感染小鼠与马拉塞齐亚spp.研究真菌-主机相互作用

该协议描述了建立一个新的小鼠模型，以研究皮肤真菌，马拉塞齐亚，及其与哺乳动物皮肤在体内的相互作用。与体外方法相比，这种感染模型允许在完全复杂和组织特定的方式研究对马拉塞齐亚的先天和适应性免疫机制。马拉塞齐亚与各种皮肤疾病有关，如特应性皮炎。

了解真菌的免疫反应可能提供新的策略，以治疗这种频繁和慢性炎症性皮肤疾病。实验室皮肤感染马拉塞齐亚提供了一个期待已久的模型，研究皮肤共性真菌如何调节免疫系统，从而影响各种皮肤疾病的过程和严重程度。准备马拉塞齐亚注射10毫升的液体mDixon介质和三到五个单独的马拉塞齐亚菌落从MDixon阿加板到无菌的100毫升埃伦迈尔烧瓶。

然后将烧瓶在 30 摄氏度下放置，每分钟旋转 180 次，48 到 96 小时。当培养物是奶油色和浊性时，将培养物的两毫升转移到无菌的两毫升微离心管中，通过离心沉淀酵母。将颗粒重新在一毫升PBS中进行第二次离心，然后用有力的移液将一毫升新鲜PBS重新增充。

使用 PBS 稀释 Malassezia 悬浮液 20 至 50 次，以确保读数介于 0.1 和 1 之间，并在光谱仪上测量 OD 600。在PBS中，与四个OD 600的一卷等量，相当于每只动物被感染的两毫升无菌管，通过离心沉淀酵母。然后重新在200微升原生橄榄油中重新供应颗粒。

要引发 Malassezia 感染，请确认麻醉的 6 至 8 周大雌性 C57 Black6 小鼠对踏板反射缺乏反应，并给动物的眼睛涂抹软膏。使用卡钳测量两只耳朵两个不同区域的厚度，以便计算每只耳朵的平均厚度。然后将一小块胶带涂抹在一只耳朵的皮肤上，然后每次使用新胶带将胶带从耳皮上快速取下五次。

剥离后，使用无菌移液器将100微升的马拉塞齐亚橄榄油悬浮液涂抹到每只耳朵的背侧，并注射200微升的无菌、预战的2%葡萄糖溶液皮下到努卡折叠中，以支持新陈代谢和再水合。然后让鼠标在加热垫上恢复 30 分钟，然后将动物返回到笼子。在适当的实验时间点，使用卡钳测量每个小鼠耳朵的两个不同区域，以便计算每个耳朵的平均厚度。

为了测量受感染皮肤的真菌负担，在蒸馏水中加入500微升无菌0.05%NP40，并在每耳一个两毫升的微离沙管中自动处理五毫升直径的钢球，并在平衡上称重每个管。接下来，从基地的每个动物中采集耳朵，将组织放入NP40的单个管中。在平衡下称量每个管，确定每个耳样的重量，然后以 25 赫兹使耳组织均质 6 分钟。

然后将每个样品的100微升分配到mDixon阿加子板上，并在30摄氏度下倒置孵育之前，将悬浮液均匀地分配到阿加片上。这里显示了在液体mDixon介质和mDixon agar上生长的马拉塞齐亚符号的生长具有代表性的图像。与野生C57 Black6小鼠的未扰动皮肤相比，Malassezia furfur应用到被阻隔的皮肤后，耳朵厚度增加。

事实上，随着时间的推移，耳朵厚度的增加量化表明，与车辆处理的皮肤相比，厚度的变化是显著的。此外，感染马拉塞齐亚帕奇德马提斯后的第二天，耳皮的真菌负担是高于检测限值的100至1000倍。马拉塞齐亚倾向于形成聚合体，不容易挂起。

因此，通过广泛涡流确保油真菌悬浮液的均质化。其他读数可能包括，组织学确定皮肤病理学和免疫细胞从皮肤分离和排干淋巴结，以研究抗真菌免疫反应。该模型为研究对马拉塞齐亚的免疫反应和研究真菌在各种皮肤疾病背景下的共生作用提供了机会。

马拉塞齐亚物种在一些国家被归类为BSL-2生物。请务必遵守当地当局的规定，并采用适当的安全措施。