通过化学测量方法，从活体共聚焦拉曼光谱中解决水、蛋白质和脂质

直接测量水、蛋白质和脂质，在人体中具有深度分辨率，对于皮肤相关疾病，对于护肤品性能的表征非常重要。该方法连同随后的分析，利用化学计量方法提取化学信息。该技术的主要优点是，它允许训练有素的仪器操作员收集临床 Raman 数据集，这些仪器操作员缺乏识别、排除和修复所有光谱伪影来源的技术专业知识。

然后可以处理生成的数据集，以识别分析之前需要从日期中排除的异常值。在数据分析过程中，一个关键挑战是删除异常值，并识别数据集中关键组件的数量。本视频显示，该方法利用了临床数据集和化学计量方法的先前知识，成功地提取了水、蛋白质和脂质的深度分辨率。

演示该程序将是李阳，我们的C&T实验室的技术人员。首先，让主体放置一个标记的病变体部位或控制部位，与体内共体拉曼仪器的成像窗口保持密切联系。确保它们覆盖整个窗户，以避免房间光线对成像的影响。

然后，打开软件并移动焦点，直到看到类似于此处所示的频谱。之后，将焦点移离皮肤表面 10 微米。使用 1 秒的曝光时间，在此处显示的频率区域中收集 26 个步骤的数据，其步进尺寸为 2 微米。

测量每个区域的 8 个复制，总共持续 15 分钟。首先，使用命令窗口和 MATLAB 将收集的数据的文件扩展名从 ric 更改为垫。然后将垫文件加载到 MATLAB 软件平台，如下所示。

使用自动加权最少平方方法更正数据集的基线，方法是进入 PLS_Workspace 窗口并右键单击导入的数据集、滚动到"分析"、选择"其他工具"并单击预处理。在弹出的窗口中，单击"显示"。然后，将"可用方法"工具栏向下滚动到"自动加权租用方块基线"筛选，然后选择"添加"。

接下来，单击"确定"以设置选项，并应用预处理数据。保存此Spectra_baseline。接下来，返回到命令窗口并使用基线更正结果替换数据。

现在，转到文本编辑器并运行此处所示的程序。这将总结 2910 和 2965 反厘米之间的值，以便从 26 个连续步骤测量中获取每个 Raman 光谱下的强度值，并将其存储在 Excel 文件中。在 MATLAB 中，转到工作区并设置数据在Depth_save路径，如图所示。

接下来，使用此处描述的过程使用 MATLAB 中的 linspace 函数将仪器偏移值从 26 到 260 进行插值。此过程将利用新生成的 260 位置值，使用样条方法将强度值从 26 值插值到 260。此外，它还将分别使用 260 位置和强度值作为多边形函数的 x 和 y 输入，将度值设置为 20。

然后，它将使用输出系数和 260 扩展位置值作为多值的输入，以获得最终的 260 强度值。接下来，它将计算平均强度，并在曲线中查找最接近均值强度的点。它还会根据皮肤表面在已知的两微米步进尺寸中更改深度值。

现在，运行程序。将拉曼光谱数据集移除后加载到 PLS_TOOLBOX 软件中，在 MATLAB 平台下右键单击数据集以选择"分析"，然后选择 PCA。接下来，单击"选择预处理"。

选择"规范化"作为预处理方法。然后，为交叉验证选择"无"。然后，使用 PCA 分解分析的三个组件构建模型。

现在，删除体内拉面仪器采集窗口的盖板，并使用用于参考材料数据收集的相同参数收集高频区域的房间光谱。通过与房间光背景的比较确定房间光效应因子。现在，查看分数并删除与正常值相比显著增加的光谱。

这意味着删除整个数据集的 99.8% 以上的分数值，在这项研究中为 0.16。保存生成的校准 X 块数据。最后，转到PLS_Workspace并编辑新文件。

选择"行标签"，然后转到"硬删除排除"以在重新保存文件之前永久删除排除的数据。首先使用刚才显示的相同方法更正拉曼光谱基线。接下来，对预处理数据集执行 PCA 分析。

通过单击"选择组件"按钮，在对数比例中绘制特征值以及组件数，然后选择日志（特征值）作为 y 值。要执行多变量曲线分辨率分析，首先使用数据选择按钮将数据集加载到MCR_main中。手动选择组件数量，将组件编号设置为 3 到 8 之间。

然后，在"初始估计"选项卡下，单击"纯"按钮。接下来，选择"集中"并单击"完成"按钮。屏幕刷新后，单击"确定"按钮，然后打开"继续移动到下一页"。

现在，单击"继续"，在"实施"下，应用 fnnls。然后，从下拉菜单中选择六个，用于非负性配置文件的物种数量，然后单击"继续"。在下一页上，选择相同的参数，然后单击"继续"。

为了确定皮肤表面的位置，整合了蛋白质拉曼峰下的区域，以获得蛋白质信号的深度剖面。皮肤表面定义为插值深度剖面的强度值最接近平均强度的位置。皮肤表面的确切位置不需要与实验数据点重合。

本视频中描述的数据收集协议共收集了 30，862 个拉曼光谱。此大型光谱数据集包含 20% 的光谱异常值。正确识别和去除异常值光谱对于实现正确的数据集非常重要。

在这里，可以看到房间灯的贡献，叠加在房间灯的参考光谱上。对预处理的共合 Raman 数据集进行了原理分量分析，此处绘制了特征值以及使用的因素数。因子9的特征值显著减少。

此观察建议对在多变量曲线分辨率模型中包含的三到八个因素之间变化的主要分量数进行调查模型。尝试此过程时，在皮肤表面上方启动深度轮廓以准确确定皮肤表面的位置至关重要。这种方法能够调查护肤品对关键皮肤成分（包括水、蛋白质和脂质）的影响。