该协议允许在真核细胞中同时调制许多微RNA，并且基于一种非常简单和灵活的方法，可最大限度地减少分子克隆步骤。这项技术对研究体外微RNA功能相互作用有影响，但更重要的是，它为在治疗中更有效地使用微RNA提供了一个平台。我们主要在脑癌的背景下开发和使用它，但它适用于任何涉及基因表达的多重改变的疾病。
我们已经在其他模型中测试了我们的人工转基因，如乳腺癌和甲状腺癌线，显示这种技术的可重复性。生物信息学和微RNA生物学的基本知识有助于此协议，但不是不可或缺的。生物信息学方法对于定义相关的微RNA组合和TRK-11非常重要，而熟悉微RNA处理对于了解如何将这些不同的微RNA组装成人工DNA簇非常重要，这些DNA在稳定到特定细胞后可以成功处理。
要涂上盘子，首先以每毫升100微克的浓度将聚D-lysine溶解在水中。每 25 平方厘米表面以 1 毫升溶液将溶液倒入盘中。旋转的菜，以确保覆盖整个菜。
六小时后吸气聚D-晶酸溶液，并用PBS冲洗两次。板人神经干细胞在5毫升的介质中，无论是干细胞培养基、星细胞分化培养基还是神经元分化培养基，都相当于10万个细胞。细胞电镀后，将培养皿放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中一周，然后根据手稿进行微RNA表达分析。
要培养GBM-34胶质母细胞瘤干细胞样细胞，从1倍十到第五细胞和5毫升神经基础培养基开始，在25平方厘米的低附着烧瓶中。将烧瓶放入摄氏37度和5%的二氧化碳孵化器中。电镀后48小时，每7天加入双倍的DNA氧化硅剂特莫佐洛米德浓度。
首先添加五微摩尔TMZ，在五毫升介质中补充五天。五天后，取出介质，代之以没有特莫佐洛米德的新鲜介质，使存活的细胞恢复。48小时后，加入10微摩尔特莫佐洛米德，再孵育5天。
重复双倍的特莫佐洛米德治疗，直到达到至少100微摩尔的浓度，细胞对药物产生抗药性。诱导电阻后，使用1毫升的Lysis试剂说谎细胞。提取总RNA，根据手稿分析特定微RNA的表达。
要获得先前定义的每个微RNA的预测靶位，请使用微RNA靶向预测工具。从 TargetScan 的头版，从预先填充的下拉菜单中选择感兴趣的微 RNA。单击提交按钮。
使用下载表链接将生成的目标列表下载为电子表格。为了减少误报预测的机会，请仅将目标包括在保存的站点列和下游分析中。其他微RNA预测程序获得进一步的串联性，并且只包括所有算法都通用的目标。
然后，打开托普金套房 20。为了评估每个微RNA常见的通路的丰富性，粘贴在训练基因集窗口中获得的目标列表。单击 HGNC 符号作为输入类型。
单击提交并开始。该程序提供了一个输出表，显示输入的基因列表最重要的 GO 类别。要最终确定每个微RNA对公共通路或细胞过程的调节的贡献，请打开生物信息学和进化基因组学网站提供的文图功能。
根据特定细胞过程所涉及的基因的完整列表检查每个获得的目标组。如果每个感兴趣的微型RNA的目标信使RNA都在各自的窗口中，则上传复制粘贴列表。使用唯一标识符命名每个列表。
单击"提交"。该程序提供一个文图的可视化输出，包含每个扇区的基因数，以及每个子集和交点组合的信使RNA的完整列表。要将选定的微RNA分组到功能性转基因中，获得基于miR-17-92聚类位点的转基因基架。
从组合基因组浏览器获取核苷酸序列。选择大约 800 个碱基对核心序列，包括该位点的所有六个编码的微RNA发夹和核心序列的上游和下游至少 200 个核苷酸侧翼序列。将序列粘贴到任何单词编辑程序中。
通过以 miR 基检索六个本机毛针的顺序，定义每个毛针的顺序。在以前标识的核心序列范围内标记每个序列。每个发夹之间的任何序列表示分位器序列。
接下来，从miR基获取在转基因中过度表达的微RNA的发夹序列。仔细注意微处理器裂解位点中的特定核苷酸。从核心序列中删除本机发夹序列，但每个发夹的五端和末端的三到五个核苷酸除外，这些核苷酸将作为新发夹的接受器。
粘贴所需微 RNA 的发夹序列，以替换以前删除的发夹。在转基因的两个侧翼区域添加所需的限制序列，以方便子克隆进入选择的传递载体。验证所选限制序列本身中不存在。
为了验证转基因的二维结构，将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件程序RNA Webfold中。选择标准程序设置，然后单击"继续"。分析图形输出，特别是对于存在至少 11 个核苷酸与微处理器裂解位点有双绞合茎结构存在明确定义的发夹。
此外，查找发夹序列中缺少分支点。此时，转基因已准备好通过基因合成产生，并克隆到所需的传递载体中。这种方法允许对三个微型RNA的模块进行表征，这些RNA在脑肿瘤中一直受到向下调节，在神经元分化期间特别共同表达。
在基因毒性应激期间，微RNA模块的共表达模式得到确认，并暗示了这三个微RNA之间的强协同活性。设计的转基因可以同时重述三个微RNA在体外和体内细胞中的表达，对肿瘤生物学有重大干扰，并有望实现转化适用性。此外，转基因集群在乳腺癌模型中也发挥作用。
该协议的关键要求是保持转基因中处理器裂解的原始大小。并确保保持嵌合微RNA发夹的茎环结构。通过这种方法，我们可以将多个生物活性微RNA基因浓缩成非常短的DNA序列，这些DNA序列可以真正地安装在任何基因治疗的传递载体中。
此方法是研究不同微RNA之间的功能相互作用和干扰复杂的多因素细胞通路，否则将需要多种药物组合的理想方法。
