Этот протокол позволяет одновременно модулировать многие микро РНК в эукариотических клетках и основан на очень простом и гибком методе, который сводит к минимуму шаги молекулярного клонирования. Этот метод имеет последствия для изучения микро РНК функциональных взаимодействий in vitro, но что более важно, он обеспечивает платформу для более эффективного использования микро РНК в терапии. Мы в основном разработали и использовали его в контексте рака мозга, но это относится к любым заболеваниям, где многочисленные изменения экспрессии генов участвуют.
Мы протестировали наши искусственные транс-гены в других моделях, таких как линии рака молочной железы и щитовидной железы, показывающие воспроизводимость этого метода. Базовые знания биоинформатики и биологии микроРНК полезны для этого протокола, но не необходимы. Подход к биоинформатике важен для определения соответствующих комбинаций микроРНК и TRK-11, в то время как знакомство с микро-РНК обработки measurably важно понять, как эти различные микро РНК могут быть собраны в искусственные кластеры ДНК, которые могут быть успешно обработаны после стабильной для конкретных клеток.
Чтобы покрыть блюдо, сначала растворите поли-D-лизин в воде в концентрации 100 микрограмм на миллилитр. Налейте раствор в блюдо в количестве одного миллилитра раствора на 25 квадратных сантиметров поверхности. Закружить блюдо, чтобы убедиться в охвате всего блюда.
Через шесть часов аспирировать раствор поли-Д-лизина и промыть дважды с помощью PBS. Плита человеческих нервных стволовых клеток в количестве 100 000 клеток на пять миллилитров среды, либо в среде стволовых клеток, астроцитарной дифференциации среды или нейрональной дифференциации среды. После покрытия клеток поместите блюдо в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и пяти процентах углекислого газа в течение одной недели и приступайте к проведению анализа экспрессии микроРНК в соответствии с рукописью.
Для культуры GBM-34 глиобластома стволовых клеток, начать с одного раза десять пятых клеток и пять миллилитров нейробазальной среды в 25 квадратных сантиметров низкой колбы крепления. Поместите колбу в инкубатор при 37 градусах Цельсия и пятипроцентной двуокиси углерода. Через 48 часов после покрытия, добавить удвоение концентрации ДНК алкилативного агента темозоломида каждые семь дней.
Начните с добавления пяти микромолейных ТМЗ, дополненных пятью миллилитров среды в течение пяти дней. Через пять дней удалите среду и замените свежей средой без темозоломида, чтобы выжившие клетки могли восстановиться. Через 48 часов добавьте 10 микромоляров темозоломида и инкубировать еще на пять дней.
Повторите удвоение лечения темозоломидом до тех пор, пока не будет достигнута концентрация не менее 100 микромолеев и клетки не станут устойчивыми к препарату. После индукции резистентности, лежат клетки, использующие 1 миллилитр реагента лиза. Извлекайте общую РНК и анализируйте экспрессию конкретных микроРНК в соответствии с рукописью.
Для получения прогнозируемого целевого показателя каждой микроРНК, ранее определенной, используйте инструменты микроРНК, ориентированные на прогнозирование. С первой страницы TargetScan выберите микро РНК, представляющие интерес, из заранее заселенного меню drop down. Нажмите кнопку отправки.
Загрузите полученный список целей в качестве электронной таблицы по ссылке таблицы загрузки. Чтобы уменьшить вероятность ложноположить прогнозы, включите только цели в столбец сохраненных сайтов и анализ ниже по течению. Дополнительные программы микро-РНК прогнозирования получить дополнительную строгость и включают только цели, которые являются общими для всех алгоритмов.
Затем откройте ToppGene Suite 20. Для оценки обогащения путей, которые являются общими для каждой микро РНК, вставьте список целей, полученных в окне набора генов обучения. Нажмите на символ HGNC в качестве типа входа.
Нажмите представить и начать. Программа предоставляет таблицу вывода, показывающую наиболее значимые категории GO для введенного списка генов. Чтобы, наконец, установить вклад каждой микроРНК в регулирование общего пути или клеточного процесса, откройте функцию венн-диаграммы, представленную на веб-сайте Bioinformatics and Evolutionary Genomics.
Проверьте каждый полученный тарем против полного списка генов, участвующих в конкретном клеточном процессе. Если целевые РНК-мессенджеры для каждого микроРНК, представляющие интерес, находятся в соответствующих окнах, загрузите копию-вставьте список. Назовите каждый список с уникальным идентификатором.
Нажмите представить. Программа обеспечивает визуальный выход венн-диаграммы с числом генов в каждом секторе, а также полный список РНК-мессенджеров для каждого подмножества и пересечения комбинаций. Чтобы сгруппировать выбранные микроРНК в функциональный транс-ген, получите трансгенную эшафот на основе кластерного локуса miR-17-92.
Получить нуклеотидную последовательность из ансамблевого браузера генома. Выберите приблизительно 800 базовых парных основных последовательностей, охватывающих все шесть закодированных микро-РНК шпильки локуса и по крайней мере 200 нуклеотидных фланговых последовательностей как вверх по течению, так и вниз по течению от основной последовательности. Вставьте последовательность в любую программу редактирования слов.
Определите последовательность каждого из шести родных волос булавки, извлекая их в miR базы. Отметь каждую из этих последовательностей в пределах ранее идентифицированной последовательности ядра. Любые последовательности между каждой шпильки представляют последовательности спейсера.
Далее, получить шпильки последовательности микро РНК, предназначенных для чрезмерно выраженного в транс-гене из miR базы. Внимательно обратите внимание на конкретные нуклеотиды, которые находятся на участках расщепления микропроцессоров. Удалите родные последовательности шпильки из основной последовательности, за исключением трех-пяти нуклеотидов как на пяти, так и на вас концах каждой шпильки, которая будет служить в качестве приемора для новых шпильки.
Вставьте волосы последовательности желаемых микро РНК для замены ранее удаленных шпильки. Добавьте желаемые последовательности ограничений в обеих фланговых областях транс-гена, чтобы облегчить суб клонирование в векторы доставки по выбору. Убедитесь, что выбранные последовательности ограничений не присутствуют в самой последовательности.
Чтобы проверить двухмерную структуру транс-гена, скопировать полную трансгенную последовательность в программу прогнозирования структуры РНК RNA Webfold. Выберите стандартные настройки программы и нажмите продолжить. Проанализируйте графический выход, особенно на наличие четко определенных шпильки в присутствии двойных мель стволовых структур, которые, по крайней мере 11 нуклеотидов проксимальных микропроцессоров расщепления сайта.
Кроме того, ищите отсутствие точек ветвки в последовательности шпильки. На данный момент транс-ген готов к синтезу генов и клонирован в нужные векторы доставки. Этот метод позволил характеристики модуля из трех микро РНК, которые последовательно вниз регулируется в опухолях головного мозга, которые совместно выражены конкретно во время нейронной дифференциации.
Были подтверждены модели совместного выражения микро-модулей РНК во время генотоксического стресса, что свидетельствует о сильной синергетической активности между этими тремя микроРНК. Разработанный транс-ген может одновременно повторить экспрессию трех микроРНК в клетках глиобластомы, как в пробирке, так и в vivo, со значительным вмешательством в биологию опухоли и перспективной переводческой применимостью. Кроме того, трансгенный кластер был также функциональным в модели рака молочной железы.
Важнейшими требованиями этого протокола являются поддержание первоначального размера расщепления процессора в транс-гене. И убедитесь, что структура стволовой петли химерной микро РНК шпильки сохраняется. С помощью этого метода мы можем сконцентрировать несколько биологически активных генов микроРНК в очень короткие последовательности ДНК, которые могут быть буквально вписаны в любые векторы доставки для использования генной терапии.
Этот метод идеально подходит для изучения функционального взаимодействия между различными микро РНК и вмешиваться в сложные многофакторные клеточные пути, которые в противном случае потребует нескольких комбинаций наркотиков.
