このプロトコルは、真核細胞における多くのマイクロRNAの同時変調を可能にし、分子クローニングステップを最小限に抑える非常にシンプルで柔軟な方法に基づいています。この技術は、インビトロでのマイクロRNA機能相互作用の研究に影響を与えますが、より重要なのは、治療におけるマイクロRNAのより効果的な使用のためのプラットフォームを提供することです。私たちは主に脳癌の文脈でそれを開発し、使用してきましたが、遺伝子発現の複数の変化が関与しているあらゆる疾患に適用されます。
この技術の再現性を示す乳癌および甲状腺癌ラインなどの他のモデルで人工トランス遺伝子を試験しました。バイオインフォマティクスとマイクロRNA生物学の基礎知識は、このプロトコルには役立ちますが、不可欠ではありません。バイオインフォマティクスのアプローチは、関連するマイクロRNAの組み合わせとTRK-11を定義するために重要ですが、マイクロRNA処理に精通していることは、これらの異なるマイクロRNAを特定の細胞に安定した一度安定に処理できる人工DNAクラスターにどのように組み立てられるかを理解するために重要です。
皿をコーティングするには、まずポリD-リジンを1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で水中に溶解する。25平方センチメートルの表面あたり溶液の1ミリリットルの量で皿に溶液を注ぎます。皿全体のカバレッジを確認するために皿を渦巻きます。
6時間後にポリD-リジン溶液を吸引し、PBSで2回リンスする。ヒト神経幹細胞を培地の5ミリリットル当たり100,000個の細胞の量で、幹細胞培地、星状分化培地または神経分化培地のいずれかでプレートする。細胞メッキ後、皿を摂氏37度、炭酸ガス5%で1週間インキュベーターに入れ、原稿に従ってマイクロRNA発現解析を行う。
GBM-34神経膠芽腫幹細胞を培養するには、25平方センチメートルの低い付着フラスコで10〜5番目の細胞と5ミリリットルの神経基底培地から始める。フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。めっき後48時間後、7日ごとにDNAアルキル化剤テモゾロミドの濃度を倍増する。
5日間の5ミリリットル培地で補充5ミクロモルTMZの追加で開始します。5日後、培地を取り除き、生き残った細胞が回復できるようにテモゾロミドを使わずに新鮮な培地に交換します。48時間後、10マイクロモル歯型テモゾロミドを加え、さらに5日間インキュベートする。
少なくとも100マイクロモルの濃度に達し、細胞が薬物に耐性になるまで、倍増テモゾロミド処理を繰り返す。抵抗性の誘導後、1ミリリットルのライシス試薬を用いて細胞を嘘をつく。全RNAを抽出し、原稿に従って特定のマイクロRNAの発現を分析します。
事前に定義された各マイクロRNAの予測標的化を得るために、マイクロRNA標的予測ツールを使用する。TargetScan のフロント ページから、あらかじめ入力されたドロップダウン メニューから目的のマイクロ RNA を選択します。[送信] ボタンをクリックします。
ダウンロードテーブルリンクを使用して、結果のターゲットリストをスプレッドシートとしてダウンロードします。誤検出予測の可能性を減らすには、保存されたサイト列と下流分析内のターゲットのみを含めます。追加のマイクロRNA予測プログラムは、さらにストリンジェンシーを得て、すべてのアルゴリズムに共通する標的のみを含みます。
その後、ToppGeneスイート20を開きます。各マイクロRNAに共通する経路の濃縮を評価するには、トレーニング遺伝子セットウィンドウで得られた標的のリストを貼り付けます。エントリタイプとしてHGNCシンボルをクリックします。
[送信] をクリックして開始します。プログラムは、遺伝子の入力されたリストの最も重要なGOカテゴリを示す出力テーブルを提供します。最終的に共通の経路または細胞プロセスの調節に対する各マイクロRNAの寄与を確立するために、バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスのウェブサイトで提供されるベンダイアグラム機能を開きます。
[送信] をクリックします。プログラムは、各セクターの遺伝子の数と各サブセットと交差の組み合わせのためのメッセンジャーRNAの完全なリストとのベン図の視覚的な出力を提供します。選択したマイクロRNAを機能的なトランス遺伝子にグループ化するには、miR-17-92クラスター遺伝子に基づいてトランスジェニック足場を得る。
アンサンブル化されたゲノムブラウザから塩基配列を取得します。軌跡の6つのコード化されたマイクロRNAヘアピンと、コア配列の上流および下流の両方の少なくとも200ヌクレオチドの横並び配列を包含する約800塩基対コア配列を選択する。任意の単語編集プログラムにシーケンスを貼り付けます。
6 つのネイティブ ヘア ピンのそれぞれについて、miR ベースで取得して、それぞれのシーケンスを定義します。前に識別されたコア シーケンスの範囲内でこれらのシーケンスのそれぞれをマークします。各ヘアピン間のシーケンスは、スペーサー シーケンスを表します。
次に、miR塩基からトランス遺伝子で過剰発現されるマイクロRNAのヘアピン配列を得る。マイクロプロセッサ切断部位にある特定のヌクレオチドに注意してください。新しいヘアピンのアクセプタとして機能する各ヘアピンの5つから5つの端の両方で3〜5ヌクレオチドを除いて、コア配列からネイティブのヘアピン配列を削除します。
必要なマイクロ RNA のヘアピン シーケンスを貼り付けて、以前に削除したヘアピンを置き換えます。トランス遺伝子の両方の隣接領域に所望の制限配列を追加して、選択した送達ベクターへのサブクローニングを容易にする。選択した制限シーケンスがシーケンス自体に存在しないことを確認します。
トランス遺伝子の2次元構造を検証するには、RNA構造予測ソフトウェアプログラムRNA Webfoldに完全なトランスジェニック配列をコピーします。標準プログラム設定を選択し、[続行] をクリックします。グラフィカル出力を分析し、特にマイクロプロセッサ切断部位に近い少なくとも11ヌクレオチドである二本鎖ステム構造の存在下で明確に定義されたヘアピンの存在について分析する。
また、ヘアピン シーケンス内に分岐点がない場合も探します。この時点で、トランス遺伝子は遺伝子合成によって作製され、所望の送達ベクターにクローン化される準備が整っている。この方法は、脳腫瘍で一貫して調節されている3つのマイクロRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経細胞分化中に特に共発現される。
遺伝子毒性ストレス時のマイクロRNAモジュールの共発現パターンが確認され、これら3つのマイクロRNAの間で強い相乗活性が示唆された。設計されたトランス遺伝子は、生体外および生体内の神経膠芽腫細胞における3つのマイクロRNAの発現を同時に再現することができ、腫瘍生物学に有意な干渉を及び翻訳適用性を有望としている。さらに、トランスジェニッククラスターは乳癌モデルでも機能していた。
このプロトコルの重要な要件は、トランス遺伝子におけるプロセッサ切断の元のサイズを維持することです。そして、キメラマイクロRNAヘアピンのステムループ構造が保存されていることを確認してください。この方法により、複数の生物学的に活性なマイクロRNA遺伝子を非常に短いDNA配列に濃縮することができ、文字通り遺伝子治療用の任意の送達ベクターに生体外に取り付けることができます。
この方法は、異なるマイクロRNA間の機能的相互作用を研究し、それ以外の場合は複数の薬物の組み合わせを必要とする複雑な多因子細胞経路を妨害するのに理想的です。
