热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选

我们的协议作为一种工具，寻找抑制膜结合热磷酸盐的去活性的化合物。这种抑制剂可用于治疗几种寄生虫病。该协议是廉价和简单的生产稳定的颜色很长一段时间，不显示任何干扰，在酶重新激活所需的高磷脂浓度的存在。

准备 10 毫升的再活化缓冲液，在 PH 6.5 时包含 20 毫摩尔 M-E-S，按甘油体积计为 3.5%，以 2 毫摩尔 D-T-T 和 0.05%D-D-M 为单位。准备10毫升的反应混合器，含有200毫摩尔三盐酸盐在PH 8。8毫摩尔氯化镁，333毫摩尔氯化钾和67毫摩尔氯化钠。

准备每毫升脂质体30毫克，用于酶重新激活。首先，在PH 8中加入10毫升20毫升的三氯酸三酸三叶草，从大豆中加入1毫摩尔D-T-T至0.3克Lα磷脂酰胆碱。将脂体放在冰上，用一秒后间隔进行声波处理，间隔一分钟。

暂停一分钟，重复，直到溶液变为透明黄色。在100微升中对脂质体进行等，冷冻液氮并储存在负80摄氏度，直到使用。要重新激活酶，请将脂体溶液在室温下解冻。

将脂体溶液的 40 微升与 22.5 微升 20%D-D-M 混合。将混合物保持在55摄氏度，15分钟。并允许它冷却到室温。

然后，添加 36.5 微升的重新激活缓冲液。混合，加入一微升浓缩蛋白，使总浓度为每毫升0.13毫克。接下来，将20微升的重新激活酶转移到反应混合物的1480微升。

轻轻混合，立即使用。首先，溶解D-M-S-O中的化合物，在200微升中制造50毫摩尔的库存溶液。对于可溶性化合物，用水稀释库存溶液至微管中一毫升，给予2、10和100微摩尔。

对于每次稀释，涡旋复合溶液，以进行适当的混合。之后，检查复合发散，并使用多通道移液器，将75微升的反应混合物分配到96井板的每个井中。将每种化合物和水加入75微升作为三分之一的控制，并上下五次通过移液混合。

使用微孔板肾上计以 300 伏测量每孔。为了准备砷酸盐溶液，重量为5克砷酸钠和5克柠檬酸二合一，将两种化合物溶解到100毫升水中。然后，加入五毫升的冰川醋酸。

混合，并加入水到250毫升，储存在室温下防止光线。接下来，准备溶液 A，加入10毫升冰冷0.5摩尔盐酸至0.3克抗坏血酸，通过涡旋溶解抗坏血酸。通过将一毫升冰冷水加入70毫克四氢铵，并加入涡流溶解，准备溶液B。

将溶液 A 和 B 存放在冰上。准备浓度为零、62.5、250和500微摩尔的磷酸盐标准进行校准。将零微升、12.5 微升、50 微升和 100 微升 5 毫摩尔磷酸二氢化物添加到含有 370 微升反应混合物的四个微管中。

用水最多一毫升。现在，将溶液B的1毫升加入到10毫升溶液的溶液中，用手混合并储存在冰上。使用多通道移液器，在三白酸的管脚本中加入 40 微升零、62.5、250 和 500 微摩尔磷酸盐标准。

然后加入25微升的复合溶液和15微升的M-P-P-A溶液混合物。除了含有磷酸盐标准的管子。用粘合密封片密封管条。

切割密封板以分离每个管条。接下来，在71摄氏度下预孵育样品5分钟。将样品放在加热块上，每个条带之间有 20 秒的间隔。

对于每个条带，打开胶粘剂密封。使用多通道移液器，添加 100 微升两个摩尔丙酸钠二基。通过上下移液五次混合。

使用相同的密封再次密封管条。在71摄氏度下再次孵育5分钟。之后，将样品放在冷却装置上，每个条带之间间隔 20 秒。

让他们冷却五分钟，然后将每个条带短暂离心，以将水滴滴掉在密封表下。将条带放回冷却装置，取出密封，让它们再冷却五分钟。然后加入60微升溶液 A 和 B，上下移液混合五次，将管条放在冷却装置上 10 分钟以上。

在烟罩中，加入90微升的砷酸盐溶液，并在室温下保持至少30分钟。产生稳定的蓝色。将每种反应混合物的 180 微升分配到透明 96 孔聚苯乙烯微孔中。

使用微孔板分光光度计测量每孔在 860 纳米的吸光度。在该协议中，八种化合物与一种热磷酸酶的常用抑制剂——I-D-P一起进行了测试，作为阳性控制。加入溶液 A 和 B 后，加入砷酸盐，在室温下孵育 30 分钟内用蓝色孵育。

所有三种浓度的非抑制化合物，都表现出相同的蓝色强度。以及E-1至E-3没有任何抑制剂。酶活性图与每种试验化合物的浓度相对，表明具有抑制活性的化合物形成了非线性曲线拟合。

I-D-P 作为正对照图，明显地显示了较高浓度下活动的减少。化合物一、五、六、七和八的抑制曲线。显示一半最大抑制浓度在1.7微摩尔，21.4微摩尔，58.8微摩尔，239.0微摩尔，和大于500微摩尔，分别。

请记住准备 M-P-P-A 解决方案。就在分析开始之前