基于荧光的连续核酸内切酶偶联DNA甲基化测定，用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂

像我们这样强大的酶标仪检测对于潜在甲基转移酶抑制剂的初步筛选非常有用。实时收集数据的能力是连续核酸内切酶偶联测定的一大优势。首先在冰上的微量离心管中分别制备含有20微摩尔和50微摩尔化合物的600微升测定条件。

为此，向每个试管中加入双蒸水和5X甲基化缓冲液，以达到1X甲基化缓冲液的最终浓度。接下来，向每个样品中添加 3.15 微升每毫升 20 毫克牛血清蛋白或 BSA。然后，向每个样品中加入两微升 3.15 微摩尔发夹 DNA 底物和 1.33 微升 4.75 微摩尔 S-腺苷蛋氨酸或 SAM。

向适当的样品中加入抑制剂，以达到21微摩尔或52.5微摩尔的终浓度和等量的二甲基亚砜（DMSO），然后通过以每分钟3， 000转的速度涡旋3秒来混合溶液。然后，将样品在1， 200倍G的台式小型离心机中旋转几秒钟，以确保溶液收集在管底部。将每种测定溶液的95微升等分到黑色半区96孔板中的六个连续孔中。

如前所述，在微量离心管中制备75微升Gla I或DNMT1加Gla I酶溶液至一次性缓冲液的终浓度。接下来，向每种溶液中加入 1.2 微升每微升 Gla I 的 10 单位，以达到每微升 0.16 单位的最终浓度。向DNMT1加Gla I溶液中加入0.6微升5微摩尔缺乏RFTS的DNMT1，最终浓度为40纳摩尔。

轻轻混合后，将样品在1， 200 G的台式小型离心机中旋转几秒钟，以确保溶液收集在管底部。然后，将12微升每种酶溶液等分到锥形底部96孔板中的六个孔中。对于DNA样品的甲基化测定，将酶标仪预热至37摄氏度。

然后，将含有测定溶液的黑板插入酶标仪中。以425 CPM摇动板后，以485纳米的激发波长和528纳米的发射波长测量荧光。然后，将板在 37 摄氏度下孵育五分钟。

从读板器中取出测定板，向每个孔中加入5微升酶溶液，然后通过上下移液混合溶液。将板插入读板器并摇动板，然后每53秒记录一次荧光，持续30分钟。获得每种条件的一式三份Gla I对照测定的平均荧光，并从在缺乏RFTS的DNMT1存在下获得的三次重复迹线中减去含有对照反应托盘的平均Gla I。

然后，确定校正重复的平均值和标准误差。绘制平均校正反应迹线并将初始线性部分拟合到一条线上以确定初始速度。通过将在化合物存在下观察到的速度除以在含有对照反应的DMSO中观察到的速度并乘以100来确定活性百分比。

不连续的核酸内切酶偶联测定的结果表明，完全甲基化的产物DNA被保护免受切割，证实了缺乏RFTS的DNMT1具有活性并且能够甲基化半甲基化底物DNA。在基于荧光的测定中，在没有Gla I的情况下，单独添加DNMT1或缓冲液不会影响背景荧光。随后将Gla I添加到所有测定中，仅在含有DNMT1的测定中产生荧光。

将缺乏RFTS的DNMT1和Gla I同时添加到三种测定中，可产生稳定的荧光。单独添加Gla I不会产生荧光。为了筛选潜在的抑制剂，在DMSO，化合物一，化合物二或化合物三存在下，以20和50微摩尔浓度检查缺乏RFTS的DNMT1的DNA甲基化活性。

在这种偶联测定中减少荧光产生的化合物必须进一步验证。确保化合物不抑制偶联酶是重要的下一步。