提取膜蛋白进行研究的经典方法是在洗涤剂中简单溶解。虽然这提供了一种简单和通用的方法，但洗涤剂已被证明能够改变这些敏感蛋白质的原生结构、功能和活性。在这里，我们将Petidisc作为稳定无洗涤剂溶液中膜蛋白的解决方案。
Peptidisc 系统自发地适应无数膜蛋白的大小、形状和类型。这与其他通常需要繁琐优化的膜模仿物形成鲜明对比。FhuA，一种大肠杆菌外膜蛋白，将被用作本协议中重组的模型靶蛋白。
外膜囊泡将被分离，然后添加洗涤剂来溶解膜蛋白。肽加入溶解，洗涤剂被稀释，自发形成Petidisc颗粒。这些稳定的可溶性颗粒现在适用于许多下游应用。
该协议将研究生物层干涉测量作为Petidisc技术的应用。该协议将侧重于PeptiQuick重组方法，这是一种有用的技术，有助于膜蛋白的同步纯化和重组。在洗涤剂中预平衡的珠子重建的PetiQuick方法在标准的镍-NTA IMAC重力柱中执行。
溶解膜被加载到树脂上，非靶点蛋白质被冲走。加入该肽后，洗涤剂迅速稀释。肽肽的疏水侧与暴露的疏水区有关。
肽的亲水性方面使蛋白质在溶液中溶解。多余的肽被冲走。伊米达佐尔被添加到精英重组的愤怒。
Peptidisc 支架可以功能化，间接标记记忆蛋白，从而为更广泛的下游分析打开大门。在这里，我们利用生物基化肽与链球菌涂层传感器进行附着，用于BLI分析。生物层干涉测量是研究溶液中生物分子相互作用的一种强大的无标签技术。
除了简单地演示交互，该技术还提供了实时动力学读出，并实现了绑定分离常量的计算。通过该协议，我们在 BLI 分析期间消除了对洗涤剂的需要，因为这可以改变活性。生物层干涉测量分析从传感器或尖端反射的白光和在相互作用过程中结合的宏观分子的干扰传递。
为了测量交互，在解决方案和每个步骤中记录的信号之间传递感应提示。然后，每个提示在森谱上给出自己的轨迹。首先，仅建立缓冲区基线。
其次，配体是绑定的。在这种情况下，FhuA 和生物素基化的 Peptidiss 结合一个链球菌素涂层的尖端。接下来，将尖端在缓冲区中洗涤，以删除任何未绑定的 FhuA。
现在，尖端被移动到一个溶液与已知的浓度分析，在这里 ColM。如果发生交互，这将给出一个绑定曲线。最后，将尖端移动到缓冲区中，并测量分离。
在每个列集中观察到的关联和分离速率可用于计算分离常数。六氯苯胺标记FhuA在大肠杆菌株AW740中表达18小时胺基。这些细菌在4摄氏度的10分钟里通过离心采集。
产生的细胞颗粒在 TSG 缓冲液中重新悬浮，然后进行分解，以分解细胞团块并确保彻底分解。TMSF 被添加到重新悬浮的细胞中，在解解前最终浓度为一毫摩尔。细胞解解是通过三个通道，要么通过微流体在15，000 PSI或法国印刷机在8000 PSI。
收集乳化细胞，在5000G的低速离心，在4度下10分钟。低速旋转的上流水液被装载到TI70超离心机中，在20万G的离心，在4度下离心40分钟，以对粗糙的大肠杆菌膜进行分粒。超离心后，上流液被丢弃，粗膜颗粒在少量 TSG 缓冲液中重新悬浮。
粗膜被分离，以确保其同质性。布拉德福德测定，以检查重新悬浮的粗膜的蛋白质浓度。TSG缓冲液用于在溶解前将粗膜稀释至每毫升约3毫克。
Triton X-100 被添加到重新悬浮的粗膜中，最终浓度为 1%，选择性地溶解细菌内膜。在四度下进行一小时，轻轻摇动。未溶解的外膜在20万G的超离心分离，在4度下4分钟。
由此产生的上因含有溶解内膜被丢弃。而含有外膜的颗粒则像在 TSG 中一样重新悬浮。LDAO 被添加到重新悬浮的外膜的最终浓度 1%中，并在四度下溶解一小时。
最后，一如和以前一样，对颗粒不溶性物质进行超离心。由此产生的上一提由来物包括溶解的外膜，包括我们的目标，他标记的FhuA，现在准备同时IMAC纯化和Petidisc重组。镍-NTA IMAC 重力柱预平衡与两列体积的 IMAC 洗涤缓冲液。
在溶解外膜中，以5毫摩尔的最终浓度添加，稀释至0.04%LDAO。溶解的外膜被加载到镍-NTA树脂上，并收集流。这种流经重新加载到树脂上，以增加FhuA的树脂结合。
装料后，用250毫升的IMAC洗涤缓冲液和收集的第一批50毫升洗涤树脂进行清洗。洗涤后，洗涤缓冲液排入树脂床的高度上方，柱子止漏关闭。一毫升浓缩，每毫升10毫克，肽肽添加到列。
在加入浓缩肽后，在 TSG 中加入 50 毫升稀释剂，每毫升 1 毫克，加入 TSG 中的肽。将树脂搅拌至 TSG 中，在 LDAO 的 CMC 下方，从而形成Petidisc颗粒。在Petidisc陷印后，允许树脂沉淀，每毫升一毫克肽溶液通过树脂排出。
树脂用50毫升 TSG 洗涤，以去除多余的肽。最后，用 TSG 中 600 毫摩尔的 50 毫升 50 毫升稀释了 Peptidisc 颗粒。收集一毫升分数，并添加 10 微升 0.5 摩尔 EDTA，一个关键光浸出的镍离子。
启动、流经、洗涤和逃避的分数被加载到 12% SDS 凝胶上，并在 60 毫安下电泳 30 分钟。凝胶在凝胶扫描仪上染色和可视化。由此产生的凝胶显示FhuA在流中耗尽，在洗脱中富集。
在未清除的分数中也观察到轻微的污染物带。选择三到七分数进行大小排除色谱，以确认 FhuA Peptidisc 溶解度和消耗污染物。30基洛多姆切断离心浓缩器用于浓缩分数三到七。
在 TSG 缓冲液中，池 IMAC elusion 分数的 1 毫升以每分钟 0.25 毫升的流速注入 S200 柱。收集一毫升分数，并运行12%的SDS凝胶的分数。相关分数是池畔的，现在可用于下游应用程序。
BLI 是在 ForteBio 八角形 RED96 中进行的。该仪器将 BLI 引脚移过 96 井板，这是首次手动设置的。所有油井的填井最终容量为200微升。
第 1 列加载动能缓冲区，以允许尖端平衡并形成基线信号。第 2 列加载了配体和动力学缓冲器的预先确定的浓度。在这种情况下，FhuA 是配体，并添加到每毫升 2.5 微克的浓度中。
E 行中的提示将用作引用，并且仅加载缓冲区。第三列加载动能缓冲液，从尖端清洗多余的 FhuA。分析物的两倍连续稀释，本例中为 ColM，在第四列中从上到下加载。
这些浓度中最高的用于参考行，用于测量分析物与尖端的非特异性结合。列 5 加载缓冲区。在这里，ColM 将分离，并测量分离。
准备板后，传感器尖端托盘和准备的板将加载到 BLI 仪器中。打开BLI数据采集软件，开始新的动力学实验。"板定义"选项卡用于将 96 井板的布局输入到软件中。
在这里，配体FhuA作为负载输入，而分析体ColM作为样本输入。"分析定义"选项卡用于定义实验中每个步骤的时间长度和板旋转速度。在这里，我们包括 60 秒的基线步长，然后是 250 秒的加载步骤、300 秒的第二个基线步长、450 秒的分析组关联步长，最后是 900 秒的分离步骤。
通过选择所需的步骤并右键单击每列上的添加分析，这些步骤将单独分配给 96 井板的每个列。传感器分配卡舌用于确保 Octet 仪器从传感器托盘中的正确位置拍摄 BLI 引脚。"审阅实验"选项卡在执行之前提供实验的最终概述。
BLI 现在将由八进制 RED 执行。这将生成原始数据感性图进行分析。分析通过首先打开八进制生物数据分析软件进行。
"数据选择"选项卡用于定位实验并检查实验摘要。此处输入分析物 ColM 的浓度。接下来，使用"处理"选项卡从实验数据中减去参考信号。
基线的定义是对齐 Y 轴，就像应用其去合金速率一样。最后，选择"进程数据"。数据是此实验的隔离数据，并且选择拟合曲线。
选择部分关联和分离曲线拟合。Kd 是在此接头中计算的。大小排除色谱用于验证安布特的重组。
色谱图显示单个对称峰值，表明单分散蛋白制剂。峰值在空隙体积后产生几毫升，指示非聚合可溶性Petidisc颗粒。蛋白质聚合物在空量下会洗，而多余的洗涤剂和肽在主峰值后会洗掉。
增加洗涤形成的Petidiscs，同时仍然依附在镍-NTA珠子应耗尽后一个峰值。蛋白质聚合物通常是在重组前将记忆蛋白暴露在无洗涤剂溶液中的结果。最后的排除色谱是一个有用的诊断，以排除一个人重新构成。
在处理实验数据后，曲线与感性图是一致。此拟合的精度对于计算分离常数至关重要。剩余视图图描述了实验数据和计算拟合的区别。
这表明，对于四个不同的列浓度，三条曲线很合适。然而，对于最高浓度曲线不能产生良好的拟合。这表明，在这个较高的浓度下，有不同构的列绑定到引脚。
因此，根据 ForteBio 应用说明，这种最高浓度信号不包括在动力学分析中。其余三条曲线用于动力学分析。使用 BLI 和 Peptidisc 方法确定的 FhuA 和 ColM 之间的分离常量与其他方法确定的常量一致。
等温热量测定和纳米光度，以及微尺度热福和Petidisc产生的分离常数和我们确定的值没有显著差异。这种一致性验证了用于测量相互作用动力学的 Peptidisc BLI 方法。好了，所以，看完这段视频后，我们希望您能对PeptiQuick方法的强度和警告有一个实际的了解。
我们发现这种方法对于在完全没有洗涤剂的情况下量化FhuA ColM相互作用特别有用。我们怀疑同样的工作流程可以应用于描述任何其他受体-配体相互作用。祝你的实验好运
