肿瘤微环境免疫细胞的空间组织具有临床价值。此策略可以很容易地用于可视化、量化和映射肿瘤组织内的免疫细胞。免疫疗法彻底改变了癌症治疗。
然而，并非所有患者反应良好。此策略可能有助于定义组织免疫特征，可以预测良好的抗肿瘤反应。在进行实验之前，在控制组织上测试抗体组合和剥离技术，并验证APP在检测感兴趣的标记时是否准确。
由于图像分析方法的书面描述使用复杂的技术语言，因此将文本与视频相结合有助于更好地了解和复制该方法。用于甲醛固定、石蜡嵌入肿瘤组织部分的抗原检索，将露轴组织样本浸入COPlin抗原检索溶液罐中，将罐放入含有自来水的电压力锅中。水位不应超过罐的高度的一半，以便水不会与抗原检索溶液混合。
关闭炊具上的盖子和压力阀，用高压处理滑梯 10 分钟。在治疗结束时，拔下炊具，释放压力，然后打开盖子。在炊具中冷却30分钟后，在新的Coplin罐子中每次洗涤，用新鲜PBS清洗样品两次，5分钟，然后用疏水笔在每个组织部分周围画一个屏障。
接下来，将幻灯片浸入 PBS 中的 0.1 摩尔甘氨酸中，在室温下浸泡 15 分钟，然后将幻灯片在 PBS 中冲洗两次，如演示。第二次洗涤后，将幻灯片转移到湿度室中，并用阻截溶液覆盖每个组织部分。在室温下30分钟后，每次洗涤时用新鲜PBS-Tween冲洗两次，然后将感兴趣的主要抗体添加到每张幻灯片中，防止光线。
在孵育结束时，每次洗涤用新鲜PBS-Tween冲洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟，然后在室温下用适当的二次抗体标记部分一小时。在孵育结束时，在新鲜的PBS-Tween中冲洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟。在双蒸馏水中进行单次冲洗。
从每张幻灯片中去除多余的水，使用辅以 DAPI 和盖板幻灯片的安装介质安装组织。挤出多余的安装介质后，让幻灯片在室温下干燥 20 分钟，防止光线，然后使用全滑动扫描仪获取所有通道的图像。扫描后，打开图像分析软件中的图像，然后单击"组织"选项卡。
要将要对齐的图像导入幻灯片纸盒，请选择要从数据库中对齐的第一个图像。加载所有图像后，单击"工作流"步骤中的"下一步"以链接图像，然后拖放所有要对齐的图像到第一个图像上。当所有图像都已酌情链接时，每个图像至少使用三个引脚，指示链接图像中的同源组织特征。
使用图钉跟踪第一个图像，以检查生成的对齐质量。如果已获得满意的对齐方式，请单击"下一步"以查看图像图层并保存数据库中的复合图像。要使用用户定义的协议 APP 1 执行组织检测，请打开图像分析选项卡并在图像分析模块中打开复合图像。
单击"打开 APP"图标并选择相应的 APP。要确认 APP 工作正常，请导航到选定的组织位置，然后单击"预览"。如果结果令人满意，请单击以使用所选的 APP 处理图像。
在处理过程中，APP 将确定像素是否与组织关联，以允许将所有组织关联的像素转换为感兴趣的区域。然后，可以将新创建的感兴趣区域传输到任何对齐的图像。在分析结束时，单击"文件"和"保存"以将修改后的图像与新创建的兴趣区域一起保存。
要将组织分割成频闪和帕伦奇玛，请打开"图像分析"选项卡，然后从数据库中选择感兴趣的文件。打开 APP 2，APP 2 使用 PSR 染色图像进行组织分割。通过处理选定视野中的图像来预览 APP 2。
如果结果令人满意，请单击"运行"以处理完整图像上的 APP 2。组织感兴趣的区域将被分割成频闪和帕伦奇玛及其各自的区域确定。新创建的频闪和帕伦奇玛感兴趣区域可以传输到对齐的图像，然后导出并保存修改后的图像，如所示。
要识别和量化感兴趣的细胞群，请将感兴趣的分段图像导入图像分析模块。调整颜色后，打开 APP 3。APP 3 将检测感兴趣的细胞群，并在帕伦奇玛和频闪内量化它们。
如果结果令人满意，请对完整映像运行 APP 3。所有感兴趣的单个细胞将被标记，其组织坐标存储，并确定在频闪和帕伦奇体区域中感兴趣的细胞的密度。然后，可以像演示的一样保存修改后的图像。
要对感兴趣的细胞标记对象执行组织热图，请打开 APP 选择窗口中的用户定义协议，然后单击"运行"以提示 APP 使用抗体标记对象的坐标生成热图。以红色突出显示的热点区域包含感兴趣的细胞群体密度最高，而深蓝色区域的密度最低。特定细胞群的热图可以叠加到对齐的图像上，以提供有关这些细胞如何在肿瘤微环境内组织的其他信息。
然后导出并保存组织热图。验证标签的特异性、设计中的 AP 的准确性以及同一节上不同污渍的剥离和重新去除效率至关重要。通过集成串行成像、顺序标记和组织对齐，可以同时可视化更多的标记，并从有限的临床标本中提取更多信息。
修复肿瘤组织部分的H&E染色允许评估组织结构、细胞形态和临床相关参数，如恶性肿瘤类型、肿瘤等级和整体免疫渗透。CD34染色允许检测内皮细胞。细胞蛋白8/18染色揭示了上皮细胞的存在，而抗阿尔法平滑肌肉活性素染色允许识别纤维化，激活，肝硬质细胞。
与CD68和Desmin的抗体结合，分别允许检测巨噬细胞和肌纤维细胞。为了更好地描述肿瘤免疫渗透，可以进行T细胞标记物和血球细胞酶的染色。Picro 天狼星红色染色也可以进行可视化纤维胶原蛋白，并促进频闪和帕伦奇马分割。
可以识别染色部分内与组织关联的像素，以便特定感兴趣区域内的不同隔离区进行分割。然后，可以在每个区域内确定感兴趣的细胞群，从而可以生成组织图，其中给定细胞群的高密度区域显示为热点，密度相对较低的区域显示为冷点。这种用于识别、量化和映射组织样本中免疫细胞的方法可以适应并验证特定的研究问题和感兴趣的标记。
此策略可应用于组织微阵列，用于高通量分析。它也可以与原位杂交相结合，同时检查原位蛋白质和基因表达。我们利用这个策略从患者身上识别和映射IL-17A产生细胞的原位。
如议定书所示，几种试剂具有化学危险性，应在化学罩中使用适当的个人防护装备和预防措施执行相关程序。
