该协议演示了如何使用 In Vivo 双光显微镜在较长时间段内在同一大脑位置对细胞动力学进行重复可视化。这种技术的优点是，它使得能够成像大脑细胞元素的长期变化，包括CNS不同细胞类型之间的排列、形态和物理相互作用。这种技术在引起细胞-细胞相互作用、细胞动力学和大脑可塑性以及神经退化期间的形态变化方面特别有用。
首先准备一个4至10周大的少年或年轻成人，一只CX3CR1 GFP异质小鼠，重达17至25克，用于颅窗植入。麻醉鼠标后，使用头发修剪器剃光头部、耳朵之间的头发，大约从眼睛水平到颈部区域顶部。将鼠标移到立体定向手术站、鼻锥，并使用耳条稳定头部。
在整个过程中，将鼠标放在加热垫上。用油膏润滑两只眼睛，然后注射100微升0.25%的双糖，和100微升每毫升脱沙甲酮4毫克，在切口部位下皮。请至少等待五分钟，然后继续。
用三个交替的贝塔丁拭子和70%酒精给剃光的头放气。然后用手术刀片或剪刀做中线头皮切口。从头骨区域的后面，耳朵之间，到眼睛之间的正面区域。
切开剩余的皮肤，露出头骨。用3%过氧化氢将位于头皮和下颅的结缔组织放出血，并定位大脑区域，用立体定向坐标进行成像。使用牙科钻头将圆形开口钻入头骨约四毫米。
在钻探过程中，定期用无菌盐水和棉签滋润头骨，使大脑冷却。清除骨骼碎片，软化头骨。完成后，用尖钳小心地取出头骨的这一部分。
取出头骨后，小心地放置一个小盖玻璃，在颅骨切除术中用盐水润湿。使用无菌抹布擦干多余的盐水。使用尖施器，在窗户周围涂抹氰丙烯酸酯胶水，并允许其附着在大脑和头骨上。
将底胶涂抹在头骨的其余部分，用固化灯固化20至40秒。用最后的胶水在窗户周围创建一个井，用固化灯固化20到40秒。将一个小头板粘在头骨上，在反面半球上，用底面胶粘上颅骨切除术，然后用最后一块胶水，固化20到40秒。
小鼠醒来后，注射一种皮下剂量的丁丙诺啡SR作为术后镇痛，这就足够了72小时。用额外的盐食复活老鼠，促进健康恢复。成像可以早在植入手术后两周进行。
使用螺钉将头板安装在双光子显微镜阶段，该头板应与加热板一起保持在 35 摄氏度。将小鼠皮下注入100微升血管染料，如罗达明B.用棉签轻轻清洁颅窗表面，用70%乙醇涂抹。在窗户上放几滴水或盐水，然后将客观透镜放入溶液中。
确保激光在目标降低时关闭，并绘制路线图来表示主要血管地标，同时通过目镜查看。使用此图形可以标识双光子成像期间的特定区域。使用双光子成像收集荧光细胞和血管的图像。
有关成像参数，请参阅文本手稿，用适当的坐标仔细记录，以确保可以重新访问精确区域以进行后续成像。在这个初始成像会话中，像几个视场一样绘制，在成像结束时，将鼠标从舞台上拿开，让鼠标从麻醉中醒来，然后将其返回到其家庭笼子。在后续会话中，使用获取的注释和图像重新成像区域。
该协议用于可视化在台湾YFP-H线小鼠的Vivvo微光动力学。特定的树突，作为大脑区域精细映射的稳定地标。虽然树突是一个稳定的，一些微胶质每天移动。
单一转基因CX3CR1/GFP小鼠，用于跟踪微胶质长达8周。每次成像过程中，用于标记血管的罗达明B的注射。虽然血管保持稳定固定，但微胶质是动态的。
CX3CR1/GFP 小鼠，用于在严重癫痫发作之前和之后跟踪微胶质。血管床结构得到维持，但微胶质细胞网络、位置景观瞬息万变。在缉获后24至48小时内观察到较大的变化。
双转基因CX3CR1/GFP和NG2DS-红小鼠，用于跟踪微胶质，NG2到Vivi的阳性细胞。在不标记血管、微胶质以及血管相关寄生虫和卵石细胞前体前体细胞或OPCs的情况下被识别。寄生虫有沿着血管壁的拉长过程，而OPC通常显示更大的细胞体，它们位于脑膜瘤中，远离血管。
使用罗达明B时，尽管成像过程中也有类似的激发，但寄生虫的荧光与发光罗丹胺的微弱荧光可以区分开来。每日成像显示，寄生虫的位置稳定，而OPCs和微胶质是动态的。必须仔细观察所可视化的区域，绘制尽可能准确的代表性地图，并指为到达起点的其他地点所采取的步骤。
在随后的成像会话中，这些步骤、手绘地图和以前拍摄的图像对于反复识别相同位置至关重要。这项技术使研究人员能够阐明在健康和病理学中长时间的神经元-胶质相互作用、神经-免疫相互作用和神经细胞动力学。
