实验自身免疫性脑脊髓炎中枢神经系统淋巴细胞渗透的流量细胞计量分析

我们在这里介绍的协议将有助于我们了解淋巴细胞如何参与中枢神经系统自身免疫性疾病的发展。用这种方法，可以按细胞研究大脑中的淋巴细胞。该协议也适用于分析免疫细胞特征和功能所需的其他模型和中枢神经系统疾病。

在这段视频中，该协议可以很容易地演示如何诱导模型和分离大脑中的单细胞。在确认对踏板反射缺乏反应后，使用一毫升注射器将麻醉的 C57BL/6 小鼠注射 100 微克乳化 MOG 35-55，在 100 微升完全 Freund 的辅助剂中，将完全 Freund 的辅助剂注射到颈部附近的两个不同位置。在同一天和免疫后的第二天，内向小鼠注射200微升，每微升百日咳毒素工作溶液1纳米。

第二次注射后，用加热垫将小鼠转移回其家笼并监测直至完全卧化。第二天和整个疾病过程中，检查所有小鼠，并盲目地检查和分级，检查表上概述的神经体征和体重的任何变化。在适当的实验终点点，小心地将颅骨从鼻子切到颈部，将每个动物的大脑从颅箱转移到含有10毫升RPMI介质的50毫升管中。

将管子混合好，去除粘附的红血球，并通过吸气去除介质。在每个管子中加入10毫升的新鲜介质，并将大脑转移到单独的100毫米的盘子中。最后用剃须刀切开每个大脑，用塑料移液器将尽可能多的组织从一盘和六毫升的培养皿中转移到冰冷七毫升的玻璃中均质器中。

使用软柱塞的松散柱塞研磨大脑，然后使用紧柱塞将组织带到，直到悬浮液是均匀的。然后，将产生的组织浆倒入冰上预冷却的 15 毫升锥形管中。当所有样品均质化后，用新鲜介质将每管的体积调整为7毫升，然后将每个组织悬浮液添加到一个新的冷冻15毫升管中，每管含有3毫升100%基底膜基质。

通过反转混合几次，并使用三毫升移液器仔细缓慢地在每个组织溶液样品下添加一毫升 70% 密度梯度溶液。通过密度梯度离心分离细胞，并移除几乎所有的顶层，注意完全去除所有的米林。将接口转移到新的 15 毫升管中，用新鲜介质将音量调节到 10 毫升。

然后再次离心样品，取出上先液，然后将颗粒重新插入每管约100微升的介质中。对于收获的脑细胞的流动细胞测量分析，将大约2倍10的6个细胞分配到96孔板的单个孔中。当所有细胞都镀光后，将100微升的500X细胞刺激鸡尾酒加上蛋白质运输抑制剂加入井中，并将板放在细胞培养培养箱中4小时。

在孵化池结束时，通过离心和重新泵化每个孔100微升流动细胞仪缓冲液中的颗粒，将井底的细胞重新填充。用三个微升的抗小鼠CD16/CD32 Fc块预孵育细胞，在4摄氏度下预孵10分钟，然后染色。阻止任何非特定 Fc 调解的交互。

在孵化结束时，将感兴趣的抗体鸡尾酒添加到每一个井中，并将板放在四摄氏度的温度下，防止光线。30分钟后，用每口井100微升流动细胞体缓冲液清洗井，通过离心沉淀细胞。丢弃超钠后，向每井添加200微升细胞内固定缓冲液。

在室温下孵育30至60分钟后，通过离心收集样品，并在每井1倍渗透缓冲液的200微升中重新填充颗粒。再次将样品离心，在丢弃上流液后，用新鲜渗透缓冲液将颗粒重新在 100 微升中。接下来，加入适当的抗体，以检测任何感兴趣的细胞内抗原，在4摄氏度下孵育30分钟，不受光线影响。

在孵化结束时，向每井添加100微升1X渗透缓冲液，通过离心将样品向下旋转。然后，在200微升流动细胞测量染色缓冲液中重新填充染色细胞，并根据标准协议通过流式细胞仪分析细胞。EAE 的典型临床过程应导致疾病曲线和体重变化，如图所示。

C57BL/6小鼠接种MOG 35-55疫苗通常开始出现疾病症状约第10天至第12天，并在第15至21天左右达到疾病高峰。在发病前，免疫小鼠的体重逐渐增加，然后随着疾病症状的增加而减少。然而，小鼠通常不能完全恢复，通常继续发展单相慢性病病理学。

正如这个具有代表性的流动分析所表明的，干扰素伽马产生Th1和IL17产生Th17细胞在EAE小鼠中显著增加。最重要的步骤是 3.10。操作员应转移中间层和光线，小心地尽可能少地使用其他层。

按照这些协议，我们可以进一步T淋巴细胞的进一步转录分析研究