外子跳过直接重新编程的线管从人类尿衍生细胞获得

我们已经建立了一个新的协议，直接重新编程人类尿液衍生细胞到脑管。这种体外建模使我们能够评估从杜氏肌营养不良患者派生的肌管中跳槽。我们发现，3-二甲苯丙胺A盐酸盐，DZnep，是组蛋白甲基转移酶抑制剂可以显著促进直接筛选UDC到肌管在短时间内。

这种基于自体 UDC 的疾病建模可导致各种肌肉疾病的应用精确医学。首先，在室温下以400 x g将整个尿样离心10分钟。接下来，吸上一代在管中留下一毫升。

将颗粒单独重新在剩余的一毫升尿液中。将它们收集在单个50毫升管中，并在管中加入10毫升的洗涤缓冲液。在室温下以200 x g离心样品10分钟。

吸上一液在管中留下0.2毫升。将细胞颗粒重新在4.5毫升的原培养中等物中。将细胞播种在三孔明胶涂层的六孔板中，每孔1.5毫升的细胞悬浮液。

37摄氏度的培养和5%的二氧化碳。三天内每天添加1.5毫升的主要介质。在第四天，用1.5毫升的生长介质代替，如手稿中所述。

第四天后，每隔一天更换一次补充生长介质，直到 UDC 培养量达到 80% 到 90% 的汇合。然后取出介质，用 PBS 清洗细胞。使用0.25%的三辛-EDTA拆分细胞。

每平方厘米的密度为3000至5000个细胞，将细胞播种到新的明胶涂层60毫米培养皿上。在明胶涂层的60毫米培养皿上，以每平方厘米3000至5000个细胞为UDC播种，并放在培养箱中。播种24小时后，在200次感染时，用解冻的逆转录病毒感染细胞。

使用新鲜介质，六溴二烯溴化物浓度为每毫升8微克。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育24小时。要选择 MYOD1 转导细胞，请用含有每毫升紫霉素一微克的新鲜生长培养基取代培养基。

每隔一天继续更换一次介质，持续7至10天。将 MYOD1 转导 UDC 板在胶原蛋白涂层的多井板中。孵育细胞24小时后，将生长介质更改为手稿中描述的分化介质。

三天后，将分化介质更改为新的分化介质，无需DZNep。每三天继续更改一次介质。将反义寡核苷酸转染到 MYOD1 转导 UDC 中，混合 ASO 转染试剂和分化介质，最终浓度为 1 至 10 微摩尔。

用这种混合物代替井中的介质。在37摄氏度和5%湿度下孵育板。在与 ASO 孵育 72 小时后，将介质更改为新的分化介质，无需 ASO。

ASO转染后三到七天，去除分化介质。用 PBS 清洗 UDC 一次，并添加细胞解液缓冲液。使用RNA提取试剂盒收获总RNA。

使用分光光度计测量RNA浓度。如手稿所述，将试剂组合在 PCR 管中，用于一步RT-PCR。将 PCR 管放在热循环器中并运行热循环器。

执行微芯片电泳并计算 exon 跳过效率。UDC在初级培养的一周内很容易、无创地被收集起来，并形成殖民地。MYOD1在分化介质中与DZNep的转染UDC可以相互融合，并有效地形成多核的核管。

Rt - pcr 清楚地检测到 Exon 跳过 Myod1 - Udcs 派生自杜氏肌营养不良患者。跳过效率取决于 ASO 的剂量。西方的印迹也检测到剂量依赖的外向跳过。

在 ASO 转染一周后用荧光显微镜测量肌营养不良素的强度。在使用 ASO 治疗的 MYOD1-UDC 中观察到的荧光信号明显高于对照。我们可以模拟任何肌肉疾病，导致了解这些疾病的病理生理学。