使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征

该方法使我们能够清楚地区分集成淀粉样蛋白结构与可溶性甚至累积的对应物。该技术以非侵入性的方式在体内进行，几乎没有毒性副作用。因为它取决于荧光素本身的荧光特性，因此随着时间的推移，它是高度健壮和可重复的。

FLIM已用于癌症诊断领域。然而，我们利用它来研究蛋白质聚集的基本机制，这些机制确实与神经退行性疾病有关。该方法可用于蛋白质聚集领域。

只要与疾病相关的蛋白质被标记在荧光探针上，就可以跟踪和监测它。可以成功研究促进或防止聚合的化合物和策略。任何允许通过光显微镜可视化的生物系统都适合在体内或外体内进行 FLIM，例如在细胞培养、固定或渗透样品以及任何必要的介质中。

在获取实验数据之前，请确保在线虫中测试所选荧光团的特性，并在获取测量结果之前测试该设置是否完全正常运行。首先，在NGM板块上生长并保持20摄氏度的线虫。将线虫年龄但直到第四天，作为年轻人，将第八天作为老年人。

在成像当天，从准备成像幻灯片开始。将加糖和双蒸馏水按体积的浓度为3%的重量放置。将其转移到微波炉中融化，然后稍微冷却。

切开一毫升移液器尖端，并服用大约200微升融化的阿加罗斯。将气糖放在干净的玻璃滑梯上，并立即将第二个放在顶部，避免形成任何气泡。让滑梯保持干燥，轻轻取下顶部玻璃滑梯。

其结果是一个玻璃幻灯片与均匀的红玫瑰表面，线虫将放置。一旦成像设置准备就绪，在立体显微镜下工作，将10微升的麻醉化合物滴到阿加罗斯垫上，轻轻将5至10个线虫转移到其中。使用睫毛尖端分离线虫。

将它们靠近，但不得接触，以便于在图像采集过程中更容易定位线虫。小心地用盖玻片覆盖线虫。安装后一小时内，进行测量。

确保线虫完全不动。打开 FLIM 采集软件。找到卡舌按钮，然后按启用输出。

将幻灯片与安装的 C.elegans 放在舞台上，并在传输模式下使用 10 倍放大镜，定位幻灯片上线虫的位置。取下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜头，然后应用所需的浸入介质。将幻灯片放在舞台上并本地化线虫。

开始扫描样品。选择感兴趣的区域并专注于其最大投影平面。在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量。

ADC 值应介于 1 倍 10 到 4 之间，1 倍 10 到 5 之间。如有必要，将焦点转移到不同的平面上或增加激光功率以收集更多的光子。确保避免光子堆积，但收集足够数量的光子，以创造良好的寿命拟合和测量。

在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。将采集设置为固定时间量或固定数量的光子。

按开始开始采集。打开软件，通过文件导入FLIM数据文件，加载FLIM数据。加载所有样品从一个条件，即使在不同的会话和不同的生物重复获得。

如有必要，通过分段、分段管理器对许多 FLIM 图片进行分段信号线虫。将裁剪工具拖动到感兴趣区域周围，直到突出显示。完成后，按"确定"。选择显示 C.elegans 强度的图像的小区域。

该区域衰减曲线出现在界面右侧的大衰减窗口中。要推断生存期，在数据选项卡上设置 40 到 300 之间的任意集成最小值，以排除任何太暗的像素，无法产生良好的拟合。选择最短时间和最大时间数，以将 FLIM 信号限制为这些值。

不要更改一个的预设计数光子。输入采集过程中用的激光的兆赫的重复率。输入栅极最大值以排除所有饱和像素。

在生存期选项卡上，选择要使用的全局拟合。如果已知所选荧光衰减是多指数且显示超过单个生存期，则除指数选择数外，不要更改任何其他参数。通过 IRF 菜单上传 IRF。

要估计 IRF 移位，请选择 IRF，估计 IRF 移位。一组值会自动显示在 IRF 选项卡上。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。

设置所有参数后，按拟合数据集。在蓝线中突出显示的结果拟合应与所有事件重叠。当所有事件都沿拟合对齐时，将获得良好的拟合。

单击软件界面右上菜单中的参数选项卡，选择统计、加权均值，并检查 chi 平方值是否尽可能接近一个。因此，所选图像的生命周期值将揭示为 tau 一。通过文件、导出强度图像、拟合结果表、图像、直方图导出任何感兴趣的信息。

在生命的第四天或第八天，C.elegans 表示肌肉 Q40 RFP 的代表地图显示在这里。IQ85 的较长 Q 延伸更易聚合，并且在直方图中表现出荧光寿命变化，这已经在生命的第 4 天。事实上，在第四天，在IQ44中观察到IQ85的后分形成。

然而，在老化时，IQ44也表现出烟叶形成，从而缩短了荧光寿命。最后，在NQ40CFP菌株中，未检测到烟叶形成，荧光寿命也降低。对于这种菌株，衰老时平均荧光寿命只有细微的非显著变化。

一旦建立了线虫模型，收集的光子数量对于获得良好的寿命拟合至关重要。该方法可进一步与不同的技术相结合，如福斯特共振能量转移、FRET、光漂白后荧光恢复、FRAP 或测量。所有这些适应提供了有关蛋白质研究及其聚合形式特性的额外信息。

在蛋白质聚集和蛋白质平衡领域，该技术允许调查对系统施加的任何扰动、不同蛋白质物种的分布以及贩运，以及一般来说，生物体内可溶性蛋白和不溶性蛋白质分数的差异和意义。麻醉钠酸中毒，应用手套和护目镜处理，并在烟罩下稀释。由于该技术是基于显微镜的，因此遵循与激光工作相关的所有警告非常重要。