Il metodo ci consente di distinguere chiaramente le strutture proteiche amiloidi integrate dalle controparti solubili e persino accumulate. La tecnica viene eseguita in vivo in modo non invasivo con pochi o nessun effetto collaterale tossico. Poiché dipende dalle proprietà fluorescenti del fluoroforo stesso, è altamente robusto e riproducibile nel tempo.
FLIM è stato utilizzato nel campo della diagnosi del cancro. Tuttavia, lo utilizziamo per studiare i meccanismi di base dell'aggregazione proteica che sono effettivamente rilevanti per le malattie neurodegenerative. La metodologia può essere utilizzata nel campo dell'aggregazione proteica.
Finché la proteina associata alla malattia viene taggata con una sonda fluorescente, può essere monitorata e monitorata nel tempo. I composti e le strategie che promuovono o impediscono l'aggregazione possono essere studiati con successo. Qualsiasi sistema biologico che consenta di essere visualizzato mediante microscopia ottica è adatto per FLIM sia in vivo che ex vivo, ad esempio in coltura cellulare, in campioni fissi o permeabilizzati e in qualsiasi mezzo necessario.
Assicurarsi di testare le proprietà del fluoroforo selezionato all'interno del nematode prima di ottenere dati sperimentali e di verificare che la configurazione sia completamente funzionante prima di acquisire misurazioni. Per iniziare, crescere e mantenere i nematodi a 20 gradi Celsius sulle piastre NGM. Invecchia i nematodi fino al quarto giorno di vita come i giovani adulti e agli otto giorni di vita degli anziani adulti.
Il giorno dell'imaging, inizia preparando le diapositive di imaging. Posizionare l'agarosio e l'acqua distillata doppia ad una concentrazione del 3% di peso in volume. Trasferirlo in un forno a microonde per scioglierlo e quindi lasciarlo raffreddare leggermente.
Tagliare la punta di una punta di pipetta da un millilitro e prendere circa 200 microlitri dell'agarosio fuso. Pipettare l'agarosio su uno scivolo di vetro pulito e posizionarne immediatamente un secondo sopra evitando la formazione di eventuali bolle. Lasciare asciugare le diapositive e rimuovere delicatamente lo scivolo superiore di vetro.
Il risultato è uno scivolo di vetro con una superficie uniforme di agarosio in cui verranno posizionati i nematodi. Una volta che la configurazione dell'imaging è pronta per l'uso, lavorando al microscopio stereo, posizionare una goccia di 10 microliter di composto anestetico su un tampone di agarosio e trasferirci delicatamente da cinque a 10 nematodi. Usa una punta per ciglia per separare i nematodi.
Tienili vicini ma non toccanti per consentire una localizzazione più facile dei nematodi durante l'acquisizione dell'immagine. Sovrapporre accuratamente i nematodi con un copripasta. Entro un'ora dal montaggio, prendere le misure.
Assicurati che i nematodi siano completamente immobili. Aprire il software di acquisizione FLIM. Individuare il pulsante di tabulazione e premere Abilita uscite.
Posizionare lo scivolo con i C.elegans montati sul palco e utilizzando un obiettivo di ingrandimento 10X in modalità di trasmissione, localizzare la posizione dei nematodi sullo scivolo. Rimuovere la diapositiva, passare all'obiettivo su un obiettivo di ingrandimento 63X e applicare il mezzo di immersione richiesto. Posizionare la diapositiva sul palco e localizzare i nematodi.
Iniziare a scansionare l'esempio. Selezionare un'area di interesse e concentrarsi sul piano di proiezione massimo. Sull'interfaccia del software FLIM, visualizzare in anteprima il numero di fotoni rilevati.
Il valore ADC deve essere compreso tra uno per 10 e il quarto e uno per 10 al quinto. Se necessario, spostare l'attenzione su un piano diverso o aumentare la potenza del laser per raccogliere più fotoni. Assicurati di evitare l'accumulo di fotoni ma raccogli una quantità sufficiente di fotoni per creare una buona vestibilità e misurazione della durata.
Nella barra dei menu selezionare la scheda per impostare i parametri di acquisizione. Selezionare la sincronizzazione della scansione per consentire il rilevamento di singoli fotoni. Impostare l'acquisizione su un determinato periodo di tempo o su un numero fisso di fotoni.
Premere start per iniziare l'acquisizione. Aprire il software e importare file di dati FLIM tramite file, caricare i dati FLIM. Caricare tutti i campioni da una condizione anche se ottenuti in sessioni diverse e da diverse ripetizioni biologiche.
Se necessario, segmentare per segnalare il nematode per molte immagini FLIM tramite segmentazione, gestore della segmentazione. Trascinare lo strumento ritaglio intorno all'area di interesse fino a evidenziarlo. Una volta completato, premere OK. Selezionare una piccola area in cui viene visualizzata l'immagine basata sull'intensità di un C.elegans.
La curva di decadimento di quella regione appare nella grande finestra di decadimento sul lato destro dell'interfaccia. Per estrapolare la durata, nella scheda dati impostare un valore minimo integrato arbitrario compreso tra 40 e 300 per escludere eventuali pixel troppo fiochi per produrre una buona vestibilità. Selezionare un numero minimo di tempo e un numero massimo di tempo per limitare il segnale FLIM a questi valori.
Non modificare il fotone di conteggio preimpostato di uno. Inserire il tasso di ripetizione in megahertz del laser utilizzato durante l'acquisizione. Immettere un valore massimo gate per escludere tutti i pixel saturi.
Nella scheda durata selezionare un raccordo globale da utilizzare. Non modificare nessun altro parametro tranne il numero di selezione esponenziale se è noto che il decadimento della fluorescenza scelto è multi-esponenziale e presenta più di una singola durata. Caricare l'IRF tramite il menu IRF.
Per stimare lo spostamento IRF, selezionare IRF, stimare lo spostamento IRF. Nella scheda IRF viene visualizzato automaticamente un insieme di valori. Una volta stabilito questo, non modificare altri parametri di questa scheda.
Una volta impostati tutti i parametri, premere fit data set. L'adattamento risultante evidenziato in una linea blu dovrebbe sovrapporsi a tutti gli eventi. Una buona vestibilità si ottiene quando tutti gli eventi sono allineati lungo la vestibilità.
Fare clic sulla scheda parametri situata all'interno dei menu in alto a destra dell'interfaccia del software e selezionare la statistica, la media ponderata e verificare che il valore del chi quadrato sia il più vicino possibile a uno. Il valore di vita dell'immagine selezionata viene quindi rivelato come tau one. Esporta qualsiasi informazione di interesse tramite file, esporta immagini di intensità, adatta tabella dei risultati, immagini, istogrammi.
Qui sono mostrate mappe rappresentative di C.elegans che esprimono la RFP Q40 muscolare il quarto o l'ottavo giorno di vita. Il tratto Q più lungo dell'IQ85 era più incline all'aggregazione e mostrava un cambiamento di durata della fluorescenza nell'istogramma già al quarto giorno di vita. Infatti, al quarto giorno, la formazione di focolai è stata osservata per IQ85 mentre era ancora assente nel QI44.
Dopo l'invecchiamento, tuttavia, L'IQ44 mostrava anche la formazione di fuochi e quindi una ridotta durata della fluorescenza. Infine, la formazione di focolai non è stata rilevata né è stata ridotta la durata della fluorescenza nel ceppo NQ40CFP. Per questo ceppo, ci sono stati solo sottili cambiamenti non significativi nella durata media della fluorescenza all'invecchiamento.
Una volta stabilito il modello di nematode, la quantità di fotone raccolto è fondamentale per ottenere una buona vestibilità a vita. Il metodo può essere ulteriormente congiunto con diverse tecniche come il trasferimento di energia di risonanza forstere, FRET, recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching, FRAP o misurazione. Tutti questi adattamenti forniscono informazioni supplementari sulle proprietà degli studi sulle proteine e sulla sua forma aggregata.
Nell'ambito dell'aggregazione proteica e dell'omeostasi proteica, la tecnica ha permesso di indagare eventuali perturbazioni imposte al sistema, la distribuzione di diverse specie proteiche, e il traffico e in generale la differenza e il significato delle frazioni proteiche solubili e insolubili all'interno dell'organismo vivente. L'azide di sodio anestetico è tossico e deve essere maneggiato con guanti e occhiali e diluito sotto un cappuccio di fumi. Poiché la tecnica è basata sulla microscopia, è importante seguire tutti gli avvisi relativi al lavoro con i laser.
