El método nos permite distinguir claramente las estructuras integradas de proteína amiloide de las contrapartes solubles e incluso acumuladas. La técnica se realiza in vivo de manera no invasiva con pocos o ningún efecto secundario tóxico. Como depende de las propiedades fluorescentes del propio fluoróforo, es altamente robusto y reproducible con el tiempo.
FLIM se ha utilizado en el campo del diagnóstico de cáncer. Sin embargo, lo empleamos para estudiar los mecanismos básicos de agregación de proteínas que son realmente relevantes para las enfermedades neurodegenerativas. La metodología se puede utilizar en el campo de la agregación de proteínas.
Siempre y cuando la proteína asociada a la enfermedad se etiquete con una sonda fluorescente, se puede rastrear y monitorear con el tiempo. Los compuestos y estrategias que promueven o impiden la agregación se pueden estudiar con éxito. Cualquier sistema biológico que permita ser visualizado por microscopía de luz es adecuado para FLIM ya sea in vivo o ex vivo, por ejemplo en cultivo celular, en muestras fijadas o permeabilizadas y en cualquier medio necesario.
Asegúrese de probar las propiedades del fluoróforo seleccionado dentro del nematodo antes de obtener datos experimentales y de probar que la configuración es completamente funcional antes de adquirir mediciones. Para empezar, crecer y mantener los nematodos a 20 grados centígrados en las placas NGM. Envejece los nematodos hasta el cuarto día de vida como los adultos jóvenes y el día ocho de la vida como los adultos mayores.
El día de la toma de imágenes, comience preparando las diapositivas de imágenes. Coloque la agarosa y el agua destilada doble a una concentración de 3% de peso en volumen. Transfiéralo a un microondas para derretirlo y luego déjalo enfriar ligeramente.
Cortar la punta de una punta de pipeta de un mililitro y tomar aproximadamente 200 microlitros de la agarosa derretida. Pipetear la agarosa sobre un tobogán de vidrio limpio e inmediatamente colocar una segunda en la parte superior evitando la formación de burbujas. Deje que las diapositivas se sequen y retire suavemente el portaobjetos de vidrio superior.
El resultado es un portaobjetos de vidrio con una superficie de agarosa uniforme donde se colocarán los nematodos. Una vez que la configuración de imágenes esté lista para usar, trabajando bajo un microscopio estéreo, coloque una gota de 10 microlitrotro de compuesto anestésico en una almohadilla de agarosa y transfiera suavemente de cinco a 10 nematodos a ella. Use una punta para pestañas para separar los nematodos.
Manténgalos juntos pero sin tocarlos para facilitar la localización de los nematodos durante la adquisición de la imagen. Superponga cuidadosamente los nematodos con un cubreobjetos. Dentro de una hora después del montaje, tome las medidas.
Asegúrese de que los nematodos estén completamente inmóviles. Abra el software de adquisición FLIM. Busque el botón de pestaña y pulse Habilitar salidas.
Coloque la corredera con los C.elegans montados en el escenario y utilizando una lente de aumento 10X en modo de transmisión, localice la posición de los nematodos en la diapositiva. Retire la corredera, cambie el objetivo a una lente de aumento 63X y aplique el medio de inmersión requerido. Coloque la diapositiva en el escenario y localice los nematodos.
Comience a escanear la muestra. Seleccione una región de interés y céntrese en su plano de proyección máximo. En la interfaz del software FLIM, previsualice el número de fotones detectados.
El valor de ADC debe estar entre uno por 10 y el cuarto y uno por 10 y el quinto. Si es necesario, cambie el enfoque en un plano diferente o aumente la potencia del láser para recoger más fotones. Asegúrese de evitar el amontonamiento de fotones, pero recopile una cantidad suficiente de fotones para crear un buen ajuste y medición de por vida.
En la barra de menús, seleccione la pestaña para establecer los parámetros de adquisición. Seleccione la sincronización de escaneado para permitir la detección de un solo fotón. Establezca la adquisición en una cantidad fija de tiempo o un número fijo de fotones.
Pulse Start para comenzar la adquisición. Abra el software e importe archivos de datos FLIM a través de un archivo, cargue los datos de FLIM. Cargue todas las muestras de una condición incluso si se obtienen en diferentes sesiones y de diferentes repeticiones biológicas.
Si es necesario, segmente para señalar nematodos para muchas imágenes FLIM a través de segmentación, gestor de segmentación. Arrastre la herramienta de recorte alrededor del área de interés hasta que se resalte. Una vez completado, pulse OK. Seleccione una región pequeña donde aparezca la imagen basada en intensidad de un C.elegans.
La curva de descomposición de esa región aparece en la gran ventana de descomposición en el lado derecho de la interfaz. Para extrapolar la duración, en la pestaña de datos, establezca un valor mínimo integrado arbitrario entre 40 y 300 para excluir los píxeles que son demasiado tenues para producir un buen ajuste. Seleccione un mínimo de tiempo y un número máximo de tiempo para limitar la señal FLIM a estos valores.
No cambie los recuentos preestablecidos de fotón de uno. Introduzca la tasa de repetición en los megahercios del láser utilizado durante la adquisición. Introduzca un valor máximo de puerta para excluir todos los píxeles saturados.
En la pestaña Duración, seleccione un empalme global que desee utilizar. No cambie ningún otro parámetro excepto el número de selección exponencial si se sabe que la decadencia de fluorescencia elegida es multi exponencial y muestra más de una sola vida útil. Cargue el IRF vía el menú IRF.
Para estimar el desplazamiento IRF, seleccione IRF, calcule el desplazamiento IRF. Un conjunto de valores aparece automáticamente en la ficha IRF. Una vez establecido esto, no cambie ningún otro parámetro de esta pestaña.
Una vez establecidos todos los parámetros, pulse el conjunto de datos de ajuste. El ajuste resultante resaltado en una línea azul debe superponerse con todos los eventos. Un buen ajuste se obtiene cuando todos los eventos están alineados a lo largo del ajuste.
Haga clic en la pestaña de parámetros situada en los menús superiores derecho de la interfaz del software y seleccione estadística, media ponderada y compruebe que el valor del cuadrado chi está lo más cerca posible de uno. El valor de vida útil de la imagen seleccionada se revela así como tau uno. Exportar cualquier información de interés a través de archivo, exportar imágenes de intensidad, ajustar tabla de resultados, imágenes, histogramas.
Aquí se muestran mapas representativos de C.elegans que expresan el musculoso Q40 RFP el día cuatro o el octavo día de la vida. El tramo Q más largo del IQ85 era más propenso a la agregación y mostraba un cambio de vida de fluorescencia en el histograma ya en el cuarto día de la vida. De hecho, en el cuarto día, se observó formación de focos para IQ85 mientras todavía estaba ausente en IQ44.
Al envejecer, sin embargo, IQ44 también exhibió formación de focos y por lo tanto una vida útil de fluorescencia reducida. Por último, no se detectó la formación de focos ni se disminuyó la vida útil de la fluorescencia en la cepa NQ40CFP. Para esta cepa, sólo hubo cambios sutiles no significativos en la vida media de la fluorescencia al envejecer.
Una vez establecido el modelo de nematodo, la cantidad de fotón recogido es primordial para obtener un buen ajuste de por vida. El método se puede unir aún más con diferentes técnicas como la transferencia de energía por resonancia Forster, FRET, recuperación de fluorescencia después de la fotoblancada, FRAP o medición. Todas estas adaptaciones proporcionan información adicional sobre las propiedades de los estudios proteicos y su forma agregada.
Dentro del campo de la agregación de proteínas y la homeostasis proteica, la técnica permitió investigar cualquier perturbación impuesta al sistema, la distribución de diferentes especies de proteínas, y el tráfico y en general la diferencia y importancia de las fracciones de proteínas solubles e insolubles dentro del organismo vivo. El azida sódica anestésica es tóxica y debe manipularse con guantes y gafas y diluirse bajo una campana de humo. Debido a que la técnica está basada en microscopía, es importante seguir todas las advertencias relacionadas con el trabajo con láseres.
