这个协议意义重大,因为它允许在发育中的鱼类中敲击和过度表达基因,以及这些下游对血细胞的影响的量化。此协议快速、易于执行、经济且易于自动化,可访问适当的仪器。证明这一程序的将是克里斯汀·鲁布,实验室的本科生研究员。
首先,在5至200之间,48小时后将受精胚胎转移到10厘米长的塑料培养皿中。倾斜菜,使胚胎下沉到底部边缘,并从菜中去除尽可能多的E3介质。然后在胚胎中加入500微升的脱毛蛋白酶。
在室温下5分钟后,将所有胚胎再次倒入盘子的底边缘,轻轻敲击盘子的侧面,让胚胎轻轻地摩擦盘子底部,完全去除它们的胆汁。使用挤压瓶添加约20毫升的E3介质稀释蛋白酶,并让胚胎沉淀。然后去除介质,用新鲜的介质再冲洗胚胎三次,就像刚刚证明的那样去除蛋白酶的所有痕迹。
要准备分离胚胎,使用 P1000 移液器将 5 到 10 个胚胎转移到一个 1.5 毫升的微离心管中,并吸气转移的 E3 介质。然后在E3介质中加入一毫升10毫升DTT到胚胎斑马鱼,并在室温下将微中线管置于水平位置30分钟,以去除粘液涂层。对于胚胎分离,用一毫升的DPBS来清洗DTT处理的胚胎三次,每次洗涤都补充钙和镁。
在加入500微升的DPBS补充钙和镁,和5微升每毫升5毫克,分离蛋白酶之前。然后在水平轨道摇床上以每分钟185转的速度在37摄氏度下孵化样品,时间为60分钟。一定要定期检查胚胎,这样你就不会过度消化它们了。
当一个不完全均匀的样品与一些固体组织存在时,用P1000移液器对胚胎进行三叉,直到样品完全分离。为了准备分离的斑马鱼胚胎细胞进行流动细胞测量,将整个细胞样本转移到一个5毫升聚苯乙烯圆底管的顶部储层,并带有35微米的细胞过滤器盖。用四毫升没有钙或镁的PBS冲洗盖子,并通过离心颗粒细胞。
然后在PBS的500微升中恢复细胞,每管不含钙和镁。对于斑马鱼胚胎细胞的流动细胞学分析,在给每个管子添加一千到一千个红死细胞污渍之前,轻轻漩涡细胞悬浮。在应用死细胞污渍的30分钟内,清空废水箱,用适当的溶液填充护套罐,启动流动细胞仪的流体系统。
在分析软件中,绘制五个绘图,并设置第一个绘图以测量前方与侧面散射。将向前散射设置为线性,侧面分散到对数。设置第二个图来测量前散射高度与前散射宽度,第三个图测量散射高度与侧散射宽度。
设置第四个绘图,以测量 x 轴上的红色死细胞污渍,并在 y 轴上侧散射,以便对死细胞中的活体进行区分。第五个情节应该设置为测量选择的氟。当所有绘图都设置完后,将样品加载到细胞仪上并降低流速,使细胞不会很快耗尽。
调整前部和侧面散射设置,以便可以清楚地观察到大部分细胞群,并在细胞群周围绘制一个门。标记此门单元格。随着第二个点图门控在细胞上,门在前进散射和侧面散射单打,以排除双打。
在第四个情节中,调整红色死细胞污渍设置,以便有明显的负数。在这些细胞周围画一个门,并标记此门活细胞。在第五个情节中,在活细胞上打开大门,在正细胞周围画一个门,然后运行每个样本,收集至少25,000个活细胞事件。
分析所有样品后,按照关闭程序关闭流体,重新填充护套罐并清空废水箱。在分析每个胚胎斑马鱼样本中GFP阳性红血球的百分比后,可以计算所有对照组的平均值。通常,平均值设置为一个百分比,所有百分比都是从此参考点计算的。
在这一具有代表性的分析中,确定用特定的变形金刚减少ISM1成绩单,减少受精胚胎后48小时内出现的GFP阳性红血球数量。通过外源性mRNA挽救ISM1变形金刚水平的降低,使红血球数量恢复正常。对样品进行适当的消化至关重要。
如果你过度消化或消化不足,你不会得到正确的结果。如果有传真机,研究人员可以通过对体外培养、RNA测序和定量RT-PCR进行分类来收集血细胞。