هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بالضربة القاضية والتعبير عن الجينات في الأسماك النامية ، وكمية تلك الآثار المصب على خلايا الدم. هذا البروتوكول هو سريع وسهل الأداء واقتصادية وسهلة لأتمتة مع الوصول إلى الأجهزة المناسبة. إثبات هذا الإجراء سيكون كريستين رويب، باحثة جامعية في المختبر.
ابدأ بنقل ما بين 5 و 200، 48 ساعة بعد الإخصاب الأجنة في طبق بيتري البلاستيك 10 سم. إمالة الطبق حتى يغرق الجنين إلى الحافة السفلية، وإزالة أكبر قدر من المتوسط E3 من الطبق ممكن. ثم أضف 500 ميكرولتر من بروتياز dechorionation إلى الأجنة.
بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بقلب جميع الأجنة إلى الحافة السفلية من الطبق مرة أخرى واضغط بلطف على جانب الطبق، مما يسمح للأجنة بفرك الجزء السفلي من الطبق بلطف لإزالة المشيمات الخاصة بها تماما. باستخدام زجاجة ضغط إضافة ما يقرب من 20 ملليلتر من E3 المتوسطة لتمييع البروتيز، والسماح للأجنة لتسوية. ثم decant المتوسطة، وشطف الأجنة ثلاث مرات أخرى مع المتوسطة الطازجة كما أظهرت للتو لإزالة جميع آثار البروتيز.
لإعداد الأجنة للتفكك، استخدم ماصة P1000 لنقل خمسة إلى 10 أجنة إلى أنبوب طرد مركزي صغير واحد، 1.5 ملليلتر، ونسيخ وسيط E3 المنقول. ثم أضف ملليلتر واحد من 10 ملليمولار DTT في E3 المتوسطة إلى حمار وحشي الجنينية، ووضع أنبوب الطرد الدقيق في وضع أفقي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة طلاء المخاط. فصاحة الأجنة، اغسل الأجنة المعالجة DTT ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS المكمل بالكالسيوم والمغنيسيوم لكل غسل.
قبل إضافة 500 ميكرولتر من DPBS المكملة بالكالسيوم والمغنيسيوم، وخمسة ميكرولترات من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر، بروتياز التفكك. ثم احتضان العينات في 37 درجة مئوية على شاكر مداري أفقي في 185 ثورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. تأكد من فحص الأجنة بشكل دوري، حتى لا تفرط في هضمها.
عندما يمكن ملاحظة عينة غير متجانسة تماما مع بعض الأنسجة الصلبة الموجودة، تريتورات الأجنة مع ماصة P1000 حتى يتم فصل العينة تماما. لإعداد الخلايا الجنينية حمار وحشي فصل لتدفق قياس الخلايا، ونقل عينة الخلية بأكملها على الخزان العلوي من خمسة ملليلتر البوليسترين جولة أنبوب أسفل، مع غطاء خلية مصفاة 35 ميكرومتر. شطف الغطاء مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم أو المغنيسيوم، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
ثم إعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم لكل أنبوب. لتحليل التدفق الخلوي للخلايا الجنينية حمار وحشي، دوامة بلطف تعليق الخلية قبل إضافة تخفيف واحد إلى ألف من وصمة عار الخلايا الميتة الحمراء إلى كل أنبوب. في غضون 30 دقيقة من تطبيق وصمة عار الخلية الميتة، وتفريغ خزان النفايات، وملء خزان غمد مع الحل المناسب، وبدء نظام السوائل من تدفق السيتومتر.
في برنامج التحليل ، رسم خمس مؤامرات ، وتعيين أول مؤامرة لقياس الأمام مقابل الجانب مبعثر. تعيين مبعثر إلى الأمام إلى خطي، وجانب مبعثر إلى لوغاريتمي. تعيين المخطط الثاني لقياس ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل عرض مبعثر إلى الأمام، والمؤامرة الثالثة لقياس ارتفاع مبعثر مقابل عرض مبعثر الجانب.
تعيين المؤامرة الرابعة لقياس وصمة عار الخلية الميتة الحمراء على محور س، وتشتت الجانب على المحور ص للسماح للتمييز من العيش من الخلايا الميتة. يجب تعيين المؤامرة الخامسة لقياس الفلوروفور المفضل. عند تعيين كافة المؤامرات، قم بتحميل العينة على مقياس الخلايا وقلل معدل التدفق بحيث لا تنفد الخلايا بسرعة.
ضبط إعدادات مبعثر إلى الأمام والجانب بحيث يمكن ملاحظة الجزء الأكبر من السكان الخلية بوضوح، ورسم بوابة حول السكان الخلية. تسمية خلايا البوابة هذه. مع مؤامرة نقطة الثانية مسور على الخلايا، بوابة على مبعثر إلى الأمام وفردية مبعثر الجانب لاستبعاد doublets.
في المؤامرة الرابعة، وضبط إعدادات بقعة الخلية الميتة الحمراء بحيث يكون هناك عدد السكان سلبية بشكل واضح. رسم بوابة حول هذه الخلايا وتسمية هذه البوابة الخلايا الحية. في المؤامرة الخامسة، بوابة على الخلايا الحية ورسم بوابة حول الخلايا الإيجابية، ثم تشغيل كل عينة جمع ما لا يقل عن 25،000 أحداث الخلايا الحية.
عندما يتم تحليل جميع العينات، اتبع إجراء إيقاف التشغيل لإيقاف السوائل، وإعادة ملء خزان الغمد وتفريغ خزان النفايات. بعد تحليل النسبة المئوية لخلايا الدم الحمراء الإيجابية GFP من كل عينة حمار وحشي جنينية ، يمكن حساب متوسط جميع مجموعة التحكم. بشكل عام، يتم تعيين المتوسط كواحد ويتم حساب كافة النسب المئوية من هذه النقطة المرجعية.
في هذا التحليل التمثيلي، تقرر أن الحد من نص ISM1 مع مورفولينو محددة، والحد من عدد خلايا الدم الحمراء الإيجابية GFP موجودة في غضون 48 ساعة بعد الأجنة الإخصاب. إنقاذ هذا الانخفاض في مستويات مورفولينو ISM1 مع الحمض النووي الريبي الخارجي، والعودة عدد خلايا الدم الحمراء إلى وضعها الطبيعي. الهضم السليم على العينات أمر بالغ الأهمية.
إذا كنت الإفراط في الهضم أو تحت هضم، فإنك لن تحصل على النتائج الصحيحة. إذا كان جهاز الفاكس متوفرا، يمكن للباحثين جمع خلايا الدم عن طريق الفرز لثقافة المختبر، وتسلسل الحمض النووي الريبي والكمية RT-PCR.
