Questo protocollo è significativo perché consente l'espressione knockdown e over dei geni in un pesce in via di sviluppo, e la quantificazione di quegli effetti a valle sulle cellule del sangue. Questo protocollo è rapido, facile da eseguire, economico e facile da automatizzare con l'accesso alla strumentazione corretta. A dimostrare questa procedura sarà Kristen Rueb, una ricercatrice universitaria in laboratorio.
Inizia trasferendo tra cinque e 200, 48 ore dopo la fecondazione degli embrioni in una piastra di Petri di plastica di 10 centimetri. Inclinare il piatto in modo che l'embrione affondi sul bordo inferiore e rimuovere il mezzo E3 dal piatto il più possibile. Quindi aggiungere 500 microlitri di proteasi di dechorionazione agli embrioni.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, puntare nuovamente tutti gli embrioni sul bordo inferiore del piatto e toccare delicatamente il lato del piatto, consentendo agli embrioni di strofinare delicatamente contro il fondo del piatto per rimuovere completamente i loro coriaci. Utilizzando una bottiglia di compressione aggiungere circa 20 millilitri di mezzo E3 per diluire la proteasi e consentire agli embrioni di depositarsi. Quindi decantare il mezzo e sciacquare gli embrioni altre tre volte con un mezzo fresco, come appena dimostrato per rimuovere tutte le tracce della proteasi.
Per preparare gli embrioni per la dissociazione, utilizzare una pipetta P1000 per trasferire da cinque a 10 embrioni in uno, 1,5 millilitro microtubo di centrifuga e aspirare il mezzo E3 trasferito. Quindi aggiungere un millilitro di 10 millimolare DTT in mezzo E3 al pesce zebra embrionale e posizionare il tubo di microcentrifugo in posizione orizzontale per 30 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il rivestimento del muco. Per la dissociazione dell'embrione, lavare gli embrioni trattati con DTT tre volte con un millilitro di DPBS integrato con calcio e magnesio per lavaggio.
Prima di aggiungere 500 microlitri di DPBS integrati con calcio e magnesio e cinque microlitri di cinque milligrammi per millilitro, proteasi di dissociazione. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale orizzontale a 185 giri al minuto per 60 minuti. Assicurati di controllare periodicamente gli embrioni, in modo da non digerirli troppo.
Quando si può osservare un campione non completamente omogeneo con qualche tessuto solido presente, triturare gli embrioni con una pipetta P1000 fino a quando il campione non è completamente dissociato. Per preparare le cellule embrionali di zebrafish dissociate per la citometria a flusso, trasferire l'intero campione cellulare sul serbatoio superiore di un tubo inferiore rotondo in polistirolo a cinque millilitri, con un tappo del filtro cellulare da 35 micrometri. Risciacquare il cappuccio con quattro millilitri di PBS senza calcio o magnesio e pelletare le cellule per centrifugazione.
Quindi rimospend le cellule in 500 microlitri di PBS senza calcio e magnesio per tubo. Per l'analisi citometrica del flusso delle cellule embrionali del pesce zebra, vortice delicatamente le sospensioni cellulari prima di aggiungere una diluizione uno a mille di macchie di globuli morti rossi ad ogni tubo. Entro 30 minuti dall'applicazione della macchia della cella morta, svuotare il serbatoio dei rifiuti, riempire il serbatoio della tona con la soluzione appropriata e avviare il sistema fluido del citometro di flusso.
Nel software di analisi, disegna cinque grafici e imposta il primo grafico per misurare la dispersione avanti rispetto a quella laterale. Impostare la dispersione in avanti su lineare e la dispersione laterale sul logaritmico. Impostate il secondo plottaggio per misurare l'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti e il terzo grafico per misurare l'altezza di dispersione rispetto alla larghezza di dispersione laterale.
Impostare il quarto grafico per misurare la macchia rossa dei globuli morti sull'asse x e la dispersione laterale sull'asse y per consentire la discriminazione del vivere da cellule morte. Il quinto appezzamento dovrebbe essere impostato per misurare il fluoroforo di scelta. Una volta impostati tutti i grafici, caricare il campione sul citometro e ridurre la portata in modo che le celle non si esaurisano rapidamente.
Regolare le impostazioni di dispersione avanti e laterale in modo che la maggior parte della popolazione cellulare possa essere chiaramente osservata e disegnare un cancello intorno alla popolazione cellulare. Etichettare queste celle del cancello. Con il secondo grafico a punti recintato sulle celle, gate on forward scatter e i singlet a dispersione laterale per escludere i farsa.
Nel quarto grafico, regolare le impostazioni delle macchie dei globuli morti rossi in modo che ci sia una popolazione chiaramente negativa. Disegna un cancello intorno a queste celle ed etichetta queste cellule vive del cancello. Nel quinto grafico, cancello sulle cellule vive e disegnare un cancello intorno alle cellule positive, quindi eseguire ogni campione raccogliendo almeno 25.000 eventi di cellule vive.
Una volta analizzati tutti i campioni, seguire la procedura di arresto per spegnere la fluidic, riempire il serbatoio della torcia e svuotare il serbatoio dei rifiuti. Dopo aver analizzato la percentuale di globuli rossi positivi alla GFP da ogni campione di zebrafish embrionale, è possibile calcolare la media di tutto il gruppo di controllo. In genere, la media è impostata come una e tutte le percentuali vengono calcolate da questo punto di riferimento.
In questa analisi rappresentativa, è stato determinato che riducendo la trascrizione ISM1 con uno specifico morfolino, si riduce il numero di globuli rossi positivi alla GFP presenti entro 48 ore dopo gli embrioni di fecondazione. Salvando questa riduzione dei livelli di morfolino ISM1 con mRNA esogeno, riportare il numero di globuli rossi alla normalità. Una corretta digestione sui campioni è fondamentale.
Se digerisci troppo o sotto-digerisci, non otterrai i risultati corretti. Se è disponibile un fax, i ricercatori possono raccogliere le cellule del sangue smistando per la coltura in vitro, il sequenziamento dell'RNA e l'RT-PCR quantitativo.
