由于这些掠夺性细菌的复杂生命周期，活细胞Bdellovibrio细菌成像一直具有挑战性。我们的协议允许实时监控整个生命周期的各个阶段。虽然我们的协议是基于一个特定的均衡菌株，它可以很容易地适应各种细菌菌株，包括致病菌株。
为了建立B.bacteriovorus培养，将一毫升新鲜24小时培养的细菌与三毫升隔夜猎物培养剂混合在250毫升的烧瓶中，含有50毫升的嬉皮士钙缓冲液，并根据需要补充抗生素。在30摄氏度和每分钟200转的24小时孵育后，检查猎物细胞已被液体安装的面部对比度显微镜完全lyly。大量的多攻击阶段B.细菌杆菌细胞应该存在，不应该看到大肠杆菌细胞或bdelloplast。
通过0.45微米孔径过滤器将B.bacteriovorus培养物应变到50毫升锥形管中，并在离心机中悬浮滤土。然后将B.bacteriovorus颗粒重新悬浮在三毫升嬉皮士钙缓冲液中，最终光学密度为600纳米（约0.2），并在30摄氏度和每分钟200转200圈时孵育细菌，30分钟。为了准备宿主细胞，从宿主兴趣菌株中选择一个菌落，并在10毫升YT介质中点结核细菌，并辅之以抗生素，必要时在37摄氏度和每分钟180圈进行夜间孵育。
第二天早上，将两毫升的隔夜培养转移到两毫升试管中，通过离心使细胞产生颗粒。然后在200微升的嬉皮士钙缓冲液中重新悬浮颗粒。离心后完全重新悬浮整个细胞颗粒，以确保猎物细胞在单个细胞水平上分离是非常重要的。
为了准备细胞的延时荧光显微镜，首先，混合200毫克的低荧光分子级阿加罗斯与20毫升的钙嬉皮士缓冲液，并在微波炉中溶解阿加罗斯。将三毫升融化的阿加罗斯倒入35毫米的玻璃底盘中，使加糖凝固。使用实验室微铲，小心地从盘子中取出阿加罗斯垫，而不干扰垫的中心杆，将垫底部侧放在培养皿盖上。
将浓缩宿主细胞悬浮液的五微升放在翻转垫上，并使用接种回路在中心极中传播细胞。接下来，在不扩散的情况下将浓缩B.bacteriovorus悬浮液的5微升添加到宿主细胞涂层表面，并快速将凝胶返回到35毫升玻璃底部盘顶部侧下。然后用盖子盖住盘子。
对于共培养的延时浮光显微镜，将菜放在培养皿架中，使该菜在实验过程中不会移动，并将一滴浸入油放在倒置的显微镜上，将一滴放在盘子底部。将支架安装在倒置显微镜室内的显微镜舞台上，在显微镜软件中将放大倍数设置为 100 倍，将多色透镜安装到 GFP 和 Mcherry。在布莱特菲尔德使用 iPS，找到焦点平面并打开无意义的管理器。
移动舞台并使用标记点按钮存储至少 10 个感兴趣位置的坐标。将摄像机 val 从 iPS 切换到监视器。设置焦平面，然后单击无意义的"管理器"中的替换点按钮以校准每个点。
打开实验设计器，并无标记疾病堆叠框。选择适当的荧光通道和最佳消除设置，并设置图像采集与实验总时间之间的间隔。为所选位置启用对焦维护，并选择应自动保存图像文件的数据文件夹。
重新检查显微镜软件控制中的所有设置，然后开始延时实验。实验的第一个小时后，检查所有阶段位置是否仍在聚焦中。延时实验完成后，取出培养皿，根据适当的生物安全方案，将35毫米的盘与阿加罗斯垫丢弃。
为了处理延时图像数据，请将实验数据传输到装有斐济软件的计算机，并在斐济打开图像。在生物格式导入选项中，选择具有超堆栈的视图堆栈。在复合颜色模式下，选择自动缩放。
通过滚动浏览图像堆栈，评估细胞和 bdelloplasts 在实验过程中是否仍然保持焦点。DNA和mNeon绿色的绿色荧光点是否存在于B.300年代生长阶段的B.310细胞中，以及掠食性生命周期的所有阶段是否都可以可视化。要分析特定的B.细菌杆菌细胞，请使用选择工具标记感兴趣的细胞。
然后复制所选区域。在复制的图像中，单击过程并平滑，对于每个荧光通道，单击图像、颜色、通道工具，然后选择感兴趣的通道。然后单击图像、调整和亮度对比度，以调整每个通道中图像的亮度和对比度。
要添加比例图条，请选择分析、工具和缩放栏。要向图像添加时间戳，请单击图像、堆栈和时间戳。要保存修改后的图像，请选择 TIF。
若要将数据另存为图像序列，AVI 要生成影片，或 PNG 以保存当前帧的单个图像。这种基于时移荧光显微镜的系统允许实时跟踪单个 B.bacteriovorus 细胞，并提供有关复杂掠食生命周期每个阶段的宝贵信息。丸状mCherry融合使整个掠食性细胞在攻击阶段以及生长阶段的早期阶段被标记。
从攻击阶段到复制阶段的转换不仅可以通过主机 bdelloplast 形成来可视化，还可以通过复制体的外观来可视化。随着繁殖阶段的推进，在入侵的细胞极中组装再体，在生长的B.1.17纤维丝中可以观察到不止一个再质量。合成染色体的几个副本后，复制将终止。
最后，多核长丝经过隔膜，后代细胞从白细胞中释放。B.细菌细胞应该足够物质，以积极寻找他们的猎物，整个细胞密度应该足够高，允许捕食性细胞附着。该平台可能有助于涉及多药耐药病原体的试验，并有助于改进B.bacteriovorus作为人类和兽医医学中活抗生素的基因工程。
