活细胞荧光显微镜研究细菌的亚细胞蛋白定位和细胞形态变化

该协议有助于在单细胞水平上直接观察各种表型变化，并允许持续监测蛋白质定位和基因表达时间。荧光显微镜的主要优点是，它是一种直接的方法，用于监测各种生物过程，如细胞分裂和活细胞的细胞形态变化。请务必特别注意样品制备协议，并探索显微镜软件，以便能够找到该协议中列出的设置和选项。

此协议的可视化表示至关重要，因为它允许用户在设置自己的实验时观看和学习技术的重要步骤。首先，用适当的膜染色染料标记感兴趣的细胞培养物的5至50微升等同物，并在35毫升玻璃底部培养皿底部的盖滑上添加5微升染色细菌细胞。将直径为 11 毫米的 agarose 板放在样品上，轻轻敲击以确保板与盖滑平。

然后在盖滑周围加入大约五微升的水，以防止红糖垫干燥，并允许培养皿与高分辨率去卷积显微镜的孵化室内的温度平衡15至20分钟。要对样品进行成像，请使用粗调整焦点旋钮，以确保在显微镜软件中初始化显微镜之前，目标完全降低。将1.517折射率油滴入100x油浸油目标，将含有样品的玻璃底盘转移到金属外壳棺材中。

轻轻地将盘子滑入舞台夹，并使用粗糙的调整旋钮提升目标，直到油与盘子的玻璃底部接触。使用目镜和微调旋钮将样品对焦，然后切换到相机模式。在"解决 3D"窗口中的映像软件中，选择"设计/运行实验"图标。

将出现一个标题为"设计/运行实验"的新对话框。打开对话框中的"设计和剖面"选项卡，以设置 Z 堆栈的数量和样本厚度。要测量样本中单元格的厚度，请使用"解决 3D"对话框中的向上和向下箭头进行增量调整 Z 平面，使单元格超出焦点作为图像采集的上限和下限。

在"解决 3D"对话框中调整"光强度的"传输百分比"和"单个选定通道的曝光持续时间"后，单击"点列表"以打开点列表。在"设计和时间推移"选项卡中，选择"时间推移"复选框并输入时间推移参数。选择"访问点"列表选项，并在文本框中输入要成像的点，用逗号或连字符分隔点，以完成序列。

然后在"运行"选项卡中编辑文件名和文件位置，并在"开始实验"对话框中选择"播放"以开始实验。在分析结束时，在适当的去卷积程序中打开感兴趣的 RAW 图像文件，然后选择"过程"选项卡和去卷。在将图像保存为 TIFF 文件之前，请根据需要在任何或所有波长通道中执行任何手动背景减噪和亮度对比度调整。

要进行单元长度量化，请打开制造商提供的软件或自由成像软件（如 ImageJ）中的去扩算图像文件，然后打开"工具"选项卡。然后选择"测量距离"，然后左键单击所需图像文件上的开始点和终点，以测量单元格长度。对于荧光信号量化，选择数据检查器。

绘制一个框，将"列/行"选项设置为特定感兴趣的维度，然后选择要量化信号的区域。添加木糖诱导GGS 8菌株会导致六细胞表型。而空向量控件看起来类似于在没有诱导剂的情况下生长的对照细胞。

金黄色葡萄球菌 gpsB 的超生产会破坏 B.子的细胞分裂，通过时间推移显微镜和细胞长度定量进行测量。此外，FtsZ或与此蛋白质相关的蛋白质的定位模式可用于记者通过时间推移成像和细胞长度定量来研究和/或识别新的抗菌化合物。请务必使用具有适当折射率的机油，因为折射率可能会根据成像使用的温度而变化。

如果用户希望消除焦点外噪声，可以执行去卷积，还可以执行涉及荧光信号量化和细胞长度和宽度测量的数据分析。