与现有的监管接受的方法相比，腐植酸定量的新标准方法提供了更准确和精确的分析，并且还为纯疏水性富里酸定量提供了标准方法。该协议的优点是，它可以在无灰的基础上对腐殖酸和疏水性富里酸浓度进行重量分析，并且对提取过程进行了优化，以从样品中获得腐殖酸和黄腐酸的最高回收率。演示该过程的将是来自我们腐殖质化学实验室的分析化学家Ryan Fountain。
要制备固体样品，请使用研钵和研杵粉碎约5克待分析的样品，直到100%的充分混合的样品可以通过美国标准筛子，网孔尺寸数为200。为了通过重量法测定粉末的水分含量，请将大约两克样品粉末转移到预加权的铝称重舟中，并记录舟和样品的质量。接下来，将称重船放入102摄氏度的干燥炉中24小时。
第二天，将船放入干燥器中冷却至少一小时，然后称量并记录称重船和干燥样品的质量，然后使用配方确定指示的水分含量。要从固体样品中提取，称量剩余样品的约2.5克，并将重量记录到小数点后四位。然后，将样品装入一升锥形瓶中，并用去离子水冲洗称重船以除去所有矿石。
用0.1摩尔氢氧化钠将烧杯填充到一升，并加入5至7厘米的磁搅拌棒，以促进样品在搅拌板上以每分钟300至400转的速度快速搅拌。当样品完全混合后，用氮气排空烧瓶的头部空间，然后用气密盖密封烧瓶开口，并将烧瓶放在搅拌板上，以每分钟300至400转的速度混合16至18小时。对于液体材料提取，请彻底摇动样品，以确保测试液体均匀混合，包括可能落到容器底部的任何残留物。
称量大约五克测试液体，并将重量记录到小数点后四位。然后，将液体加入一升量筒中，并用0.1摩尔氢氧化钠填充圆筒，最终体积为一升。使用磁性搅拌棒快速混合样品，直到测试样品完全混合，然后将混合物转移到一升锥形瓶中，然后用氮气排空头部空间，并以每分钟300 400转的速度搅拌烧瓶内容物，如图所示持续一小时。
为了从碱性提取物中除去不溶性物质，在搅拌孵育结束时，将混合物转移到合适的离心管中，并在室温下以4，921x G离心整个体积的样品30分钟。在离心结束时，将含有腐植酸和黄腐酸馏分的碱性上清液（含有疏水性富里酸）收集在带有磁性搅拌棒的清洁的一升锥形瓶中。对于从黄腐殖酸馏分沉淀，同时在搅拌板上以每分钟300至400转的速度搅拌收集的碱性提取物，将pH探针插入溶液的中间部分，并加入浓盐酸滴，直到达到pH 1.0正负0.1的稳定pH值。
一旦pH值稳定，取出探针并搅拌棒，用去离子水冲洗，并用气密盖密封烧瓶。让烧瓶静置一到六个小时，直到沉淀的腐植酸沉降到底部，然后将提取物和沉淀的腐植酸以4，921x G离心一小时。在离心结束时，将含有富里酸馏分的上清液倒入干净的一升锥形瓶中，并用气密盖密封烧瓶。
将含腐植酸的离心管放入100摄氏度的干燥炉中24小时，并确保盖子松动或取下以确保干燥。干燥后，在干燥器中冷却管子，直到它们达到室温。冷却后，使用刮刀将每个管中的残留物转移到单个焦油称重舟中，以确定提取的腐植酸样品的质量。
为了确定样品中的灰分含量，将大约30毫克干燥的腐植酸转移到干净的预称量陶瓷皿中，以确定称量样品和培养皿的质量。接下来，在600摄氏度的马弗烤箱中燃烧腐植酸两个小时，然后在干燥器中冷却盘子。冷却后，称量盘子，并使用公式计算灰分比。
要确定纯腐植酸的最终质量，请使用公式校正灰分含量。然后使用公式确定纯腐植酸浓度。要制备新的低压聚甲基丙烯酸甲酯DAX8树脂填充色谱柱，请将树脂在烧杯中浸泡甲醇两小时，然后用去离子水彻底冲洗树脂，直到除去所有甲醇。
然后除去漂浮在水面上的任何小树脂颗粒。彻底冲洗后，将冲洗或再生树脂倒入5 x 25厘米的玻璃色谱柱中，该色谱柱配有一个带有10微米色釉的端件，用于树脂床支撑，在柱的顶部留下2.5至5厘米，并将顶部部分更换到柱上。要翻新以前使用的树脂或准备新洗的新树脂，请使用蠕动泵以35至40毫升的流速泵送0.1摩尔盐酸通过柱的底部，直到流出物的pH值等于进水的pH值，然后将去离子水泵入柱的顶部，直到流出物的pH值等于进水的pH值。
树脂床填充后，使用蠕动泵将黄腐酸馏分以35至40毫升的流速通过塔的顶部在低压下加载到塔上。一旦黄腐酸馏分完全加载到树脂上，用去离子水洗涤树脂以除去非吸附的亲水性黄腐酸馏分。用去离子水洗涤色谱柱，直到柱流出物在350纳米处的吸光度等于用于洗涤色谱柱的去离子水的吸光度。
为了解吸HFA，通过塔的底部泵送0.1摩尔氢氧化钠，并将泵中的氟戊酸钠流出物捕获在干净，足够大小的容器中。当柱流出物的吸光度等于350纳米处0.1摩尔氢氧化钠进水的吸光度时，所有HFA均已解吸。要通过质子化对HFA进行脱灰，首先将质子/阳离子交换树脂倒入一个大烧杯中，盖上树脂并用新鲜的去离子水混合几次，每次冲洗后倒掉水，直到红色完全去除。
最后一次洗涤后，用一摩尔盐酸覆盖树脂，让混合物静置至少两个小时，每30分钟搅拌一次。在酸化处理结束时，用去离子水代替酸，用搅拌棒剧烈搅拌15秒，然后让树脂落到烧瓶底部并倒出水。重复该过程，直到漂洗水的电导率小于或等于每厘米0.7微西门子，并将再生树脂装入5×50厘米的柱中，并用玻璃熔块保留树脂。
然后，用新鲜的去离子水覆盖树脂，并通过重力进料反复使富尔维酸钠通过强阳离子/质子交换树脂，直到流出物的电导率低于每厘米120微西门子。为确保从树脂中除去所有FA，在最后一次通过后，用去离子水洗涤树脂，直到350纳米处流出物的吸光度与用于洗涤塔的去离子水相同。将洗涤物和用于检查吸光度的任何流出物加入纯化的FA溶液中。
为了帮助去除FA，树脂可以搅拌几次。使用55摄氏度的旋转蒸发器将FA浓缩到大约15加或减两毫升的体积，并将整个体积的FA浓缩物完全转移到50毫升的塑料离心管中。将样品干燥至60摄氏度或减三摄氏度，在干燥箱中保持恒定干燥，并将管转移到干燥器冷却。
样品冷却后，使用刮刀将提取的FA刮到一张预先称量的称量纸上，并确定原始样品中的灰分比，提取的FA重量和纯FA百分比，如腐植酸所示。在该表中，显示了从HA和HFA浓度非常不同的液体商业样品中提取HA和HFA的方法的精确数据。HA的残差标准差低于HFA，但三个液体样品的平均HFA残留标准差为6.83%，表明精度很高。
霍洛维茨比率也大于2，只有一项HFA分析。该表显示了从三个腐殖质矿石样品中提取HA和HFA的精度数据。与之前的分析类似，除从二号矿石中提取的HFA和从三号矿中提取的HA外，所有Horowitz比率均低于2，这表明该方法从腐殖质矿石样品中提取HA和HFA的精度很高。
在该分析中，没有观察到植物生物刺激素添加剂显着影响HA或HFA的回收率。在这些表格中，显示了从刺激了浓度非常低的商业产品的液体样品中HA和HFA的回收率。回收率非常好，HA的回收率在88%至97%之间，HFA的回收率为92%至104%，但也表明需要进行实验室重复。
按照这一过程，获得的干腐殖酸和富里酸可用于表征目的，例如碳-13和质子NMR电子共振，超高分辨率质谱法，以及其他有用的技术。这可用于表征腐殖质化学，以及深入研究与植物适应性和潜在植物防御机制的构效关系的有用工具。
