一种可定制的酶化生产与纯化天然产物的方法

该协议适用于生产纯化二肽，可用于不同的下游分析，并可针对一系列不同的代谢物目标进行定制。这种方法的主要优点是，它是一种简单而廉价的方法来生产微量的专用代谢物。通过交换用于共同表达的基因和酶，可以修改这种方法来产生其他三叶草，包括单肽和四叶草，以及其他代谢物类，如黄酮类。

对于二肽代谢的产生和转化，首先在冰上加热化学上称职的大肠杆菌细胞。培养体解冻后，将每个构造的25微升称称细胞添加到冰冷的1.5毫升微管中，并添加1微升，每个微升溶液100毫微克用于共同表达。在冰上孵育混合物30分钟，每10分钟轻轻混合一次，将管子刮过微管架。

在孵育结束时，热能使细胞混合物在42摄氏度下冲击一分钟，然后将细胞放回冰上至少两分钟。接下来，在管中加入200微升37摄氏度的SSC介质。在37摄氏度和每分钟200次旋转下孵育培养素一小时。

在孵育结束时，将大约10个自功能化玻璃珠和100微升细胞加入一个37摄氏度的温化乳糖汤加糖板，并加入适当的抗生素。水平摇动板，盖到位，均匀分布细胞。然后，轻轻将玻璃珠敲击到废容器中，在37摄氏度下孵育板，将表面涂层朝下。

第二天，从培养箱中取出盘子。将 5 毫升新鲜准备好的利原汤培养基与适当的抗生素添加到一个 15 毫升无菌玻璃管中，每计划 1 升培养培养的塑料可呼吸盖，并使用移液尖端从阿加板中挑选个别转化的 E.Coli 菌落。在每个准备好的 15 毫升管中加入一个采摘的菌落，并用随附的透气塑料盖盖住每个管。

然后，将盖有盖的大肠杆菌小培养物放在37摄氏度的震动培养箱中，12至24小时。第二天，用适当的抗生素将100毫升的10x PBS添加到900毫升的特好肉汤中。将烧瓶在摄氏37度，每分钟旋转140次，约30分钟。

当了不起的肉汤是温暖的，添加整个5毫升体积每个接种文化到一个1升文化烧瓶每个培养。将烧瓶以每分钟 140 次旋转的速度放在摇培养箱中，约 3 小时。当 600 纳米的光学密度达到 0.6 时，将孵化器的温度降至 16 摄氏度。

一旦孵化器冷却，加入1毫升一摩尔IPTG，1毫升新鲜准备4克每升核黄素和1毫升新鲜准备150克每升氨基。对于二甲酮生产，在每个培养中加入25毫升的一个摩尔丙酮钠，以确保足够的前体形成。然后，在16摄氏度和每分钟140次旋转下孵育培养物72小时，每天向适当的培养物中添加25毫升的丙酮钠。

对于代谢物分离和纯化，请将分离漏斗固定到烟罩中的环支架上。在漏斗下放置一个废物容器。将500毫升的50/50乙酸乙酸乙酯和六烷溶液倒入分离漏斗中。

并将500毫升的转化大肠杆菌共表达文化添加到漏斗中。将玻璃塞放在漏斗上，摇动漏斗 5 到 10 次，将培养与萃取溶剂混合，在漏斗倒置时经常打开吸气管，并将其指向烟罩中，以解气。在第二轮摇晃和脱气后，正如刚刚展示的，将漏斗直立在环支架中约一分钟。

当顶部溶剂层与水培养层分离时，拆下塞子并将大肠杆菌层排入废杯中，将溶剂层保留在漏斗内。然后，使用用于首次萃取的相同 500 毫升溶剂，用培养物的剩余 500 毫升重复萃取，然后将含有萃取代谢物的溶剂排入干净的烧瓶中。在这里，我们具有代表性的气相色谱-质谱色谱色谱仪的典型萃取酶产品显示。

通常观察到的次要副产品包括氯霉素和丁二烯衍生物奥辛多勒和二甲苯甲醛。通过二氧化硅柱色谱进行二甲酮纯化后，可获得三种多布拉莱辛化合物，根据使用二甲醇的标准曲线进行量化。硅色谱是实现目标化合物高纯度的的理想之选。

由于它使二分烯烃和含氧衍生物的简单制备，并容易去除主要污染的二氧化二氮，这是保留在二氧化硅基质上。此外，三叶草通路基因的共表达可用于在N.Benthamiana生产二肽，从而产生多拉布拉丁和15，16环氧二甲苯。萃取过程中使用的溶剂应针对感兴趣的代谢物的物理化学性质进行优化，不得与水混合以保持两个不同的层。

按照这个程序，纯化代谢物可用于下游分析，包括结构分析和抗生素酸。这项技术使得发现了新的二肽，包括这里显示的二肽，使得这些代谢物能够被分析为它们的化学结构和新的双活性。在分离漏斗中使用有机溶剂时，应采取预防措施。

请务必按照实验室安全标准处理生物废物。