平行高通量单分子动力学测定，用于现场特异性DNA裂解

该协议可应用于任何导致双滞留DNA断裂的过程，产生关于动力学的详细定量数据。虽然该方法具有单分子分辨率，但一次实验中可测量多达1000个DNA，从而提供良好的统计。该方法的主要应用是研究DNA结合和修饰所涉及的机制。

例如，我们有兴趣研究DNA靶点搜索，它对所有DNA结合蛋白相关。首次尝试这种技术时，请记住，单分子系绳是细腻的，一旦形成，必须小心处理。功能化表面的适当比例至关重要。

有一些技巧，使流动如此。除了在数据收集期间切换样品管，可视化演示还可以帮助新了解此过程的人。要清洗盖滑，请将它们放在染色罐中，用乙醇对它们进行声波处理30分钟。

用去离子和蒸馏水彻底冲洗，然后将它们浸入一个氢氧化钾中，再声化30分钟。重复洗涤顺序，确保每次洗涤后用水冲洗盖滑。将清洁过的盖板将用水存放在染色罐中。

使用干净的剃须刀切割八厘米长的装载和出口管，并将其插入干净的玻璃滑梯中的孔中。环氧管，让固化五分钟，以确保它。将带通道图案的双面胶带预切到玻璃滑梯上，用塑料钳子将其平滑，以实现良好的密封。

剥下胶带的背，并涂抹一个干净的盖滑，用钳子将其平滑。然后，环氧树脂的盖滑的边缘密封流动细胞，让它固化。根据手稿指示执行 PCR，准备标记的 DNA 进行系绳。

然后使用 PCR 清理套件净化 PCR 产品。准备 10 毫升缓冲液 A，并在真空干燥器中除气至少一小时。为了使流动细胞功能化，在PBS中注入25微升的抗二恶英和晶圆厂碎片，使用凝胶加载尖端放入PE60管中。

在室温下孵育流动细胞30分钟。孵育后，用注射器通过通道拉0.5毫升缓冲液，注意不要将空气引入通道。然后，将流动细胞放在倒置的显微镜上。

将出口管连接到注射器泵上，将进气管放入含有缓冲液 A 的微型离心管中。手动拉取至少 0.5 毫升缓冲液 A 以冲洗系统并给泵提供压力。然后让泵以每分钟 10 微升的速度运行至少 5 分钟，以平衡系统。将储存的珠子瓶，和移液器1.6微升的珠子放入50微升的缓冲器 A，然后再次涡旋它们。

将珠子放在磁性分离器上，移液器出缓冲液。将它们重新悬浮在缓冲器 A 的 50 微升中，并旋转它们。上次洗涤后，将珠子重新悬浮在100微升缓冲液 A中，最终浓度为每毫升160微克。

在缓冲液 A 中准备 480 微升 0.5 个标有 2.5 皮摩尔的 DNA 基质，将珠悬浮液的移液器 20 微升放入稀释的 DNA 中。将混合物放在旋转器上三分钟。三分钟后，立即以每分钟 10 微升的流量将样品加载到通道中 15 分钟，或直到观察到足够的珠子系绳。

通过将进气管切换到缓冲器 A 的新鲜管来清洗所有自由珠的通道，然后以每分钟 50 微升的速度将珠子流入至少 10 分钟，或直到没有观察到松动的珠子。使用内联阀来切断流量和切换管道也很有帮助。在一次平滑运动中切换油管，并确保新旧样品管中的液位匹配，以避免回流。

在收集数据之前，准备DNA裂解酶的正确浓度，并将进气管插入样品中。将磁铁低于流动单元。将泵设置为每分钟 150 微升注入 80 微升样品并开始数据收集。

一分钟后进行数据收集，激活泵。此处显示的是反应之前和之后系绳珠的代表性图像。数据分析用于量化在整个裂解反应中保持系绳的珠子数量。

该技术用于测量每毫升0.25至4个单位的蛋白质浓度和两种不同浓度的镁的Nde1的位点特异性DNA裂解率。每个条件至少复制两次，每个实验都有100到1000个系绳DNA。在足够低的蛋白质浓度下，该速率与蛋白质成正比，与镁无关。

对于高蛋白浓度，该速率取决于镁，但独立于蛋白质浓度。尝试此协议时，请记住，管道和流通道中的气泡可以运行实验。在切换油管时，请确保不允许任何空气进入管路，并在使用前将所有缓冲液除气。

系绳方法允许探索DNA中张力对反应的影响。这可以通过改变磁体强度或在数据收集过程中应用流量来实现。