在跨脊柱直流刺激期间类型识别大鼠脊柱腺瘤的 Vivo 细胞内记录

该协议使用脊柱腺瘤的细胞内记录，直接研究跨脊柱直流刺激对脊柱网络功能的影响。这种技术的主要优点是，它允许在完全成熟的神经系统上进行细胞内录音。促进实验观测结果的翻译到实际应用。

在确认对踏板反射缺乏反应后，一只麻醉了六个月大的雄性威斯塔大鼠，使用解剖显微镜和21号刀片，从胸骨到下巴进行纵向皮肤切口。并使用钝解剖来暴露右血管。将两个，4-0连字放在静脉部分下，没有分支点。

并在静脉段的近端打一个松动的结。和一个松散的结在段的端。将静脉紧拉至心脏，并夹住静脉的端端。

使用虹膜剪刀在夹子和端结字之间进行切口。并且，握住静脉的活瓣，将预填充的导管引入静脉被夹子阻塞的点。然后取下夹子，将导管推入静脉几毫米。

对于气管放置，使用钝钳分离覆盖胸腺肌肉的两个腺体。并分离在中线，以暴露气管的胸腺肌肉。将三个，4-0连字放在气管下面，并在气管插入点下方打两个节，在上面打一个节。

然后将气管插入第三气管软骨下方的气管。用预先准备的连字固定管子。要解剖后肢神经，请使用21号刀片在左后肢的后侧进行纵向切割，从跟腱到臀部。

并且用剪刀在膝关节后部的波普莱特叶的前部和后部区域之间做剪。切两个头的二头肌毛骨，暴露坐骨神经。将横向头部与胃肠肌肉的中脑头部分离，以暴露骨神经及其分支。

然后使用数字55钳子，仔细解剖中胃和横向胃和鞋底神经。断开它们与周围组织的连接，同时保持它们与各自肌肉的连接。要进行耳管切除术，请使用数字21刀片，使从囊到胸椎的纵向切口。

并识别Th13椎骨，作为一个最低的胸段与肋骨插入。然后使用细的隆格器将旋转过程和层压从 Th13 到 L2 椎骨，以暴露脊髓的腰椎部分。要固定椎柱，请将大鼠放入 37 摄氏度加热垫上的定制框架中，连接到闭环加热系统。

并使用皮肤皮瓣在裸露的脊髓上形成一个深池。将金属夹放在 Th12 横向工艺下方和 L3 旋转工艺中，并在池中加注 37 摄氏度的矿物油。使用皮肤皮瓣，使深池矿物油在暴露的三口，中侧胃肠和侧胃和鞋底神经。

将神经放在双极银线刺激电极上。然后，使用每个神经的单独刺激通道将电极连接到方形脉冲刺激器。对于表面电极放置，在解剖显微镜下，将银球电极放在暴露脊髓的左侧。

在背部肌肉中插入参考电极。将两个电极连接到差分直流放大器。使用恒定电流刺激器刺激中位胃肠和横向胃角神经，以 3 赫兹频率重复的 0.1 毫秒持续时间的平方脉冲，并观察发泡球。

在模拟结束时，以玫瑰色方式移动表面电极，并重复刺激，以确定每个神经的振幅最高的脊髓段。确定最大排球的位置后，静脉注射神经肌肉阻滞剂，使大鼠瘫痪。当助手将气管连接到外部呼吸机时，与啮齿动物兼容的帽提名器一样。

要打开 dura 和 pia 母体，请使用 55 号钳子轻轻抬起 dura 母体，然后从 L5 段（玫瑰花到 L4 段）切割组织。然后使用一对超薄的5SF钳子，在皮娅中制作一个小补丁，覆盖血管之间的支柱。正好在从中层胃和横向胃和鞋底神经的最大胃排球水平。

要放置跨脊柱直流刺激电极，请将盐水浸泡海绵放在Th12椎骨的后侧。并使用精细操作按海绵与有源的跨脊柱直流刺激电极。然后将自定义池式微电子安装到微型操纵器上，允许一到两微米步进移动和立体轴校准。

以 15 到 20 度的中向倾斜角将微移管尖端驱动到皮娅中选定的贴片中。为了记录磁膜和发射特性，在细胞内放大器的桥接模式下，刺激各自的神经分支根据全部或无外观识别莫托龙的抗变色作用潜力。在电流开关速率为 4 至 8 千赫的细胞内放大器的不连续电流夹紧模式下，使用 0.5 毫秒的细胞内极化电流脉冲，在磁毒中激发正畸作用电位。

要计算细胞输入电阻，请刺激一个莫托龙，用40个短的100毫秒脉冲超极化一个纳米电流。要确定实际基值为引出单个峰值所需的去极化电流的最小振幅，请刺激具有 50 毫秒方波脉冲的motoneuron，以增加振幅。然后注入500毫秒的平方波脉冲去极化电流，在增加振幅。

在0.1至两纳米安培的步数中，唤起莫托龙的有节奏放电。对于跨脊柱直流刺激，通过直流应用跨脊柱开始极化过程，同时保持莫托龙的稳定穿透。在这里，一个典型的正交作用潜力，由细胞内刺激引起，满足所有数据包含标准显示。

在此分析中，一个细胞响应100毫秒超极化电流脉冲的一毫图。从中可以观察到莫托龙的峰值和高原输入电阻，可以从电压偏转中确定。这种真正基本尖峰的扩展电压轨迹，显示尖峰的电压阈值清晰。

指示激活电压门控钠通道以启动作用电位的膜去极化水平。这些图表提供了细胞内电压轨迹的示例。从两个莫托龙，刺激细胞内与500毫秒的平方脉冲去极化电流。

跨脊柱直流刺激应用之前、期间和之后。发现阿诺达尔跨脊柱直流刺激对增加的莫托龙兴奋性和更高频率的节奏发射有作用。而阴极跨脊柱直流刺激，作用于对火的抑制。

此外，这两种类型的跨脊柱直流刺激的影响，超过极化时期。如果数据包含标准由于细胞穿透不完善而遭到破坏，则可以获取不准确的数据。未能补偿微电位电阻和电容或脊髓不稳定。

在解剖过程中，对脊髓不造成损伤是势在必行的，因为损伤可能导致脊髓休克，使得无法进行进一步的记录。可以采集组织样本，以进一步组织学或免疫细胞化学分析。例如，c-fos 表达式的测量可用作神经元活动的代理。