يستخدم هذا البروتوكول تسجيلات داخل الخلايا من موتونورونات العمود الفقري ، للتحقيق مباشرة في تأثير التحفيز المباشر للتيار عبر العمود الفقري على وظيفة شبكات العمود الفقري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء التسجيلات داخل الخلايا على الجهاز العصبي الناضج تمامًا. تسهيل ترجمة الملاحظات التجريبية إلى تطبيقات عملية.
بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، وهو تخدير ستة أشهر من العمر الذكور ويستر الفئران، واستخدام المجهر تشريح ونصلة رقم 21، لجعل شق الجلد الطولي من القص إلى الذقن. واستخدم التشريح الحاد لفضح الوريد الوداجي الأيمن. مكان اثنين، 4-0 الأربطة تحت قسم الوريد دون نقاط التفريع.
وجعل عقدة واحدة فضفاضة على الطرف القريب من الجزء الوريد. وعقدة واحدة فضفاضة على نهاية القاصي من الجزء. المشبك الوريد القريب إلى القلب، وligate نهاية هدّيّة من الوريد.
استخدم مقص القزحية لإجراء شق بين المشبك واللّرَب. و، عقد رفرف من الوريد، وإدخال قسطرة مملوءة مسبقا إلى النقطة التي يتم فيها سد الوريد من قبل المشبك. ثم إزالة المشبك ودفع القسطرة عدة ملليمترات في الوريد.
لوضع أنبوب القصبة الهوائية، واستخدام ملقط حادة لفصل الغدد الماندية اثنين تغطي عضلات sternohyoid. وفصل عضلات الستيروهويد في خط الوسط، لفضح القصبة الهوائية. ضع ثلاثة، 4-0 أربطة تحت القصبة الهوائية، وجعل عقدتين تحت نقطة إدخال أنبوب القصبة الهوائية وعقدة واحدة أعلاه.
ثم أدخل أنبوب القصبة الهوائية في القصبة الهوائية تحت غضروف القصبة الهوائية الثالث. وتأمين الأنبوب في مكان مع الأربطة المعدة مسبقا. لتشريح أعصاب الأطراف الخلفية، استخدم شفرة رقم 21 لإجراء قطع طولي على الجانب الخلفي من الطرف الخلفي الأيسر، من وتر أخيل إلى الورك.
واستخدام مقص لجعل قطع بين المناطق الأمامية والخلفية من فوسا popliteal، في الجزء الخلفي من مفصل الركبة. قطع اثنين من رؤساء فيموري العضلة ذات الرأسين، لفضح العصب الوركي. وفصل الرأس الجانبي عن الرأس الوسيط لعضلة الجهاز الهضمي، لفضح العصب التيبالي وفروعه.
ثم استخدام عدد 55 ملقط، لتشريح بعناية gastrocnemius الوسط والعصى الجانبي والأعصاب soleus. فصلهم عن الأنسجة المحيطة مع الحفاظ على اتصالهم بكل من العضلات. لإجراء استئصال لامينكومي، استخدم شفرة رقم 21 لإجراء شق طولي من العجز حتى الفقرات الصدرية.
وتحديد فقرة Th13، كأدنى شريحة صدرية مع إدراج الضلع. ثم استخدم الرانكورات الدقيقة لإزالة العمليات العرضية والرقي من Th13 إلى فقرات L2 ، لفضح الأجزاء القطنية من الحبل الشوكي. لإصلاح العمود الفقري، ضع الجرذ في إطار مخصص على لوحة تدفئة 37 درجة مئوية، متصلة بنظام تدفئة حلقة مغلقة.
واستخدمي رفرفات الجلد لتشكيل بركة عميقة فوق الحبل الشوكي المكشوف. ضع المشابك المعدنية تحت العمليات العرضية Th12 ، وفي العمليات العرضية L3 ، وملء المسبح بزيت معدني 37 درجة مئوية. استخدام اللوحات الجلدية لجعل بركة عميقة من الزيوت المعدنية على البيبية المكشوفة، وsall gastrocnemius وsalcnemius الجانبي والأعصاب soleus.
ووضع الأعصاب على الأسلاك الفضية الثنائية القطب تحفيز الأقطاب الكهربائية. ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمحفز نبض مربع باستخدام قنوات تحفيز منفصلة لكل عصب. لوضع قطب سطحي، تحت المجهر تشريح، ووضع قطب الكرة الفضية على الجانب السد الأيسر من الحبل الشوكي المكشوفة.
مع قطب مرجعي إدراجها في عضلات الظهر. وتوصيل كل من الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت DC التفاضلي. استخدام محفز التيار المستمر لتحفيز gastrocnemius الوسط وsalal gastrocnemius والأعصاب soleus، مع نبضات مربعة من 0.1 مللي ثانية المدة المتكررة على تردد هرتز ثلاثة ومراقبة وابل afferent.
في نهاية المحاكاة، تحريك القطب السطحي، وتكرار التحفيز لتحديد شرائح العمود الفقري التي تكون فيها السعات من القذف هي الأعلى لكل عصب. بعد تحديد موقع أقصى طائرة، وتقديم مانع عصبي عضلي عن طريق الوريد لشل الفئران. بينما يتصل المساعد أنبوب القصبة الهوائية بجهاز تنفس صناعي خارجي بما يتماشى مع حامل ترشيح قبعة متوافق مع القوارض.
لفتح الجافا وبيا ماطر، استخدم عدد 55 ملقط لرفع بلطف ماطر dura، وقطع الأنسجة caudally من الجزء L5، rostrally تصل إلى الجزء L4. ثم استخدام زوج من رقيقة جدا 5SF ملقط، لجعل رقعة صغيرة في بيا، وتغطي العمود الظهري بين الأوعية الدموية. بالضبط على مستوى أقصى afferent الطائرة من gastrocnemius الوسط و معضمي والعصب سوليوس.
لوضع أقطاب التحفيز المباشر عبر العمود الفقري، ضع إسفنجة منقوقة على الجانب الظهري من فقرات Th12. واستخدام التلاعب غرامة للضغط على الاسفنج مع نشط عبر العمود الفقري التيار الكهربائي التحفيز المباشر. ثم قم بتركيب ميكروكيلكترودي متجمعة مخصصة ، على المتلاعب الصغير ، مما يسمح بحركة خطوة ميكرون واحد إلى اثنين ومعايرة مجسمة.
ومحرك تلميح micropipette في التصحيح المحدد في بيا، في زاوية 15 إلى 20 درجة الجانبي الوسيط. لتسجيل غشاء موتونيورون وخصائص اطلاق النار، في وضع الجسر من مكبر للصوت داخل الخلايا، وتحفيز فروع العصب المعنية لتحديد motoneuron على أساس كل أو لا شيء المظهر، من إمكانات العمل المضادة للاندرامي. في وضع المشبك الحالي غير المتجاور للمكبر داخل الخلايا مع وضع معدل التبديل الحالي من أربعة إلى ثمانية كيلوهيرتز ، استخدم نبضات تيارية داخل الخلايا 0.5 مللي ثانية ، لاستحضار إمكانية عمل تقويم الأسنان ، في الـ motoneuron.
لحساب مقاومة مدخلات الخلية ، وتحفيز موتونيورون ، مع 40 نبضة قصيرة 100 مللي ثانية من فرط القطب واحد نانوغرام الحالية. لتحديد القيمة الأساسية الحقيقية باعتبارها الحد الأدنى من السعة الحالية depolarizing المطلوبة لاثارة ارتفاع واحد ، وتحفيز motoneuron مع 50 مللي ثانية نبضات موجة مربعة في زيادة السعة. ثم حقن 500 مللي ثانية نبضات موجة مربعة من التيار الزبالة، في السعة المتزايدة.
في 0.1 إلى اثنين من خطوات أمبير نانو، لاستحضار التفريغ الإيقاعي من موتونورون. لحفز تيار مباشر عبر العمود الفقري، بدء إجراءات الاستقطاب عن طريق تطبيق عبر العمود الفقري للتيار المباشر، مع الحفاظ على اختراق مستقر للmotoneuron. هنا، يتم عرض إمكانية عمل تقويم العظام النموذجية، التي أثارها التحفيز داخل الخلايا التي تلبي جميع معايير إدراج البيانات.
في هذا التحليل، استجابة الخلية لنبض 100 مللي ثانية فرط قطبية من نانوغرام واحد. من أيّ الذروة وهضّة مدخل مقاومة من [موترون], يستطيع كنت حددت من الجهد ينحرف, يستطيع كنت لاحظت. هذا الجهد الموسع تتبع من ارتفاع الأساسية الحقيقية ، ويعرض عتبة الجهد ملحوظ بوضوح من ارتفاع.
مشيرا إلى مستوى إزالة قطبة الغشاء الذي يتم تفعيل قنوات الصوديوم المسور الجهد لبدء العمل المحتملة. هذه الرسوم البيانية تقدم أمثلة على آثار الجهد داخل الخلايا. من اثنين من motoneurons، حفز داخل الخلايا مع 500 مللي ثانية نبضات مربعة من التيار depolarizing.
قبل وأثناء وبعد تطبيق التحفيز المباشر عبر العمود الفقري. تم العثور على التحفيز المباشر للتيار الانودال عبر العمود الفقري للعمل نحو زيادة الإثارة motoneuron والترددات أعلى من اطلاق إيقاعي. في حين cathodal عبر العمود الفقري مباشرة التحفيز الحالي، تصرفت نحو تثبيط اطلاق النار.
وعلاوة على ذلك، فإن آثار كلا النوعين من التحفيز المباشر عبر العمود الفقري تيار، تجاوز فترة الاستقطاب. يمكن الحصول على بيانات غير دقيقة، إذا تم اختراق معايير إدراج البيانات بسبب اختراق الخلايا غير الكاملة. فشل لتعويض المقاومة الدقيقة و السعة أو عدم استقرار الحبل الشوكي.
من الضروري أن لا يحدث أي ضرر في الحبل الشوكي أثناء التشريح حيث يمكن أن تؤدي الإصابة إلى صدمة في العمود الفقري ، مما يجعل المزيد من التسجيلات مستحيلة. فمن الممكن لحصاد عينات الأنسجة لمزيد من التحليل النسيجي أو المناعي الخلوي الكيميائي. على سبيل المثال، يمكن استخدام قياس التعبير c-fos كبديل لنشاط الخلايا العصبية.
