Этот протокол использует внутриклеточные записи спинномозговых мотонейронов, чтобы непосредственно исследовать влияние транс-спинальной стимуляции прямого тока на функцию спинальных сетей. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет внутриклеточных записей, которые будут выполняться на полностью зрелой нервной системы. Содействие переводу экспериментальных наблюдений на практическое применение.
После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, анестезированные шесть месяцев мужской крысы Wistar, использовать рассечение микроскопа и номер 21 лезвие, чтобы сделать продольный разрез кожи от грудины до подбородка. И использовать тупое вскрытие, чтобы разоблачить правую яремную вену. Поместите два, 4-0 лигатуры под секцией вены без точек ветвлений.
И сделать один свободный узел на проксимальной конце вены сегмента. И один свободный узел на дистальной конце сегмента. Зажим вены проксимальной для сердца, и ligate дистальный конец вены.
Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать разрез между зажимом и дистальной лигатурой. И, держа лоскут вены, ввести предварительно заполненный катетер до точки, где вена блокируется зажимом. Затем снимите зажим и нажмите катетер несколько миллиметров в вену.
Для размещения трахеи трубки, использовать тупые миппы, чтобы отделить две миндибулярные железы, покрывающие стернохиоидные мышцы. И отделить стернохиоидные мышцы в средней линии, чтобы разоблачить трахею. Поместите три, 4-0 лигатуры под трахею, и сделать два узла ниже точки вставки трахеи трубки и один узел выше.
Затем вставьте трахею трубки в трахею ниже третьего трахеи хряща. И закрекреть трубку на месте с заранее подготовленными лигатурами. Чтобы вскрыть нервы задних конечностей, используйте лезвие номер 21, чтобы сделать продольный разрез на задней стороне левой задней конечности, от ахиллова сухожилия до бедра.
И использовать ножницы, чтобы сделать разрез между передней и задней областях popliteal fossa, в задней части коленного сустава. Вырезать две головы бицепса бедренной кости, чтобы разоблачить седалищного нерва. И отделить боковой головки от медиальной головы мышцы гастрокнейма, чтобы разоблачить трибиальный нерв и его ветви.
Затем используйте число 55 типсов, чтобы тщательно вскрыть медиальный гастрокнеймиус и боковой гастрокнеймиус и подошвы нервов. Отключение их от окружающих тканей при сохранении их связи с соответствующими мышц. Для выполнения ламинэктомии используйте лезвие номер 21, чтобы сделать продольный разрез от крестца до грудных позвонков.
И определить Th13 позвонка, как низкий грудной сегмент с вставкой ребра. Затем используйте тонкие rongeurs для удаления спинных процессов и laminae от Th13 до L2 позвонков, чтобы разоблачить поясничных сегментов спинного мозга. Чтобы зафиксировать позвоночник, поместите крысу в специально изготовленную рамку на 37-градусной грелке По Цельсию, подключенной к замкнутой системе обогрева петли.
И использовать лоскуты кожи, чтобы сформировать глубокий бассейн над открытым спинным мозгом. Поместите металлические зажимы ниже поперечных процессов Th12, а также на спиновые процессы L3 и заполните бассейн минеральным маслом 37 градусов по Цельсию. Используйте лоскуты кожи, чтобы сделать глубокий бассейн минерального масла над открытыми тибиальной, медиальной гастрокнеймии и боковой гастрокнеймии и soleus нервов.
И поместите нервы на биполярную серебряную проволоку, стимулирующую электроды. Затем соедините электроды с квадратным стимулятором импульса, используя отдельные каналы стимуляции для каждого нерва. Для размещения поверхностного электрода, под рассеченным микроскопом, поместите электрод серебряного шара на левой хвостовой стороне открытого спинного мозга.
Со эталонным электродом вставляется в мышцы спины. И подключите оба электрода к усилителю дифференциального постоянного тока. Используйте постоянный ток стимулятор для стимулирования медиальной гастрокнеймии и боковой гастрокнеймии и soleus нервы, с квадратными импульсами 0,1 миллисекунды продолжительность повторяется на три герц частоты и наблюдать афферентные залпы.
В конце моделирования, переместить поверхности электрода rostrally, и повторить стимуляцию для выявления сегментов позвоночника, при которых амплитуды залпов являются самыми высокими для каждого нерва. После определения местоположения максимального залпа, доставить нервно-мышечный блокатор внутривенно парализовать крысу. В то время как помощник соединяет трахеи трубки с внешним вентилятором в соответствии с грызунов совместимый колпачок номинальной.
Чтобы открыть dura и пиа-матер, используйте 55 типсов, чтобы аккуратно поднять dura mater, и вырезать ткани caudally из сегмента L5, rostrally до сегмента L4. Затем используйте пару ультра тонких 5SF типсов, чтобы сделать небольшой патч в пиа, покрывая спинной столбец между кровеносными сосудами. Именно на уровне максимального афферентного залпа из медиальной гастроценемии и бокового гастроценемиуса и соленого нерва.
Чтобы поместить транс-спинной прямого тока стимуляции электродов, место солевой пропитанной губкой на спинной стороне позвонков Th12. И использовать мелкие манипуляции, чтобы нажать губку с активным транс-спинного прямого тока стимуляции электрода. Затем смонтировать пользовательский объединили микроэлектрод, на микро-манипулятор, что позволяет один-два микрона шагая движения и стереотаксисной калибровки.
И диск микропайпетт отзыв в выбранный патч в пиа, на 15 до 20 градусов медиальной боковой угол. Для записи мотонейроновой мембраны и огневых свойств, в режиме моста внутриклеточного усилителя, стимулировать соответствующие нервные ветви для выявления мотонейрона на основе всего или ничего внешний вид, антидромного потенциала действия. В режиме прерывания текущего зажима внутриклеточного усилителя с текущим режимом скорости переключения от четырех до восьми килогерц, используйте 0,5 миллисекундный внутриклеточный деполяризирующий тока импульсы, чтобы вызвать ортодонтический потенциал действия, в мотонейроне.
Чтобы вычислить сопротивление ввода клеток, стимулировать мотонейрон, с 40 короткими 100 миллисекундных импульсов гиперполяризации одного нанограммового тока. Чтобы определить реальное базовое значение как минимальную амплитуду деполяризирующего тока, необходимого для получения одного шипа, стимулируйте мотонейрон с 50 миллисекундами квадратных волновых импульсов при увеличении амплитуды. Затем ввилите 500 миллисекундных квадратных волновых импульсов деполяризации тока при увеличении амплитуды.
В 0,1 до двух нано-усилителей шаги, чтобы вызвать ритмические разряды мотонейронов. Для стимуляции транс-спинного прямого тока начните процедуры поляризации путем трансколонного применения прямого тока, сохраняя при этом стабильное проникновение мотонейрона. Здесь показан типичный ортотропный потенциал действия, вызванный внутриклеточной стимуляцией, которая отвечает всем критериям включения данных.
В этом анализе клеточный ответ на 100 миллисекундный гиперполяризирующий ток импульса одного нанограмма. Из которых можно наблюдать как пиковое, так и плато входное сопротивление мотонейрона, которое можно определить по отклонению напряжения. Этот расширенный след напряжения реального основного всплеска, демонстрирует четко обозначенный порог напряжения шипа.
Указание уровня деполяризации мембраны, при которой активируются закрытые натриевые каналы напряжения, чтобы инициировать потенциал действия. Эти графики дают примеры внутриклеточных следов напряжения. Из двух мотонейронов, стимулировали внутриклеточно с 500 миллисекундных квадратных импульсов деполяризации тока.
До, во время и после транс-спинного прямого тока стимуляции применения. Было установлено, что анодальная стимуляция прямого тока действует в направлении повышенной возбудимости мотонейрона и более высоких частот ритмической стрельбы. В то время как катодальные транс-спинного прямого тока стимуляции, действовали в направлении ингибирования стрельбы.
Более того, эффекты обоих видов транскодней стимуляции прямого тока, пережили период поляризации. Неточные данные могут быть получены, если критерии включения данных скомпрометированы из-за несовершенного проникновения клеток. Неспособность компенсировать устойчивость и емкость микроэлектрода или нестабильность спинного мозга.
Крайне важно, чтобы не было нанести никакого ущерба спинному мозгу во время вскрытия, так как травма может привести к шоку позвоночника, что делает дальнейшие записи невозможными. Можно собрать образцы тканей для дальнейшего гистологического или иммуноцитохимического анализа. Например, измерение экспрессии c-fos может быть использовано в качестве прокси нейрональной активности.
