利用两色单分子荧光在原位杂交中Escherichia coli探索大肠杆菌中空间和时间中的 mRNA 动力学

smFISH 以测量绝对数字作为 mRNA 的子细胞位置而广为人知。我们的两种颜色sMFISH协议具有测量转录和mRNA降解动力学的附加功能。使用此方法，可以同时处理许多样本，而无需额外的时间或工作量。

例如，在 8 小时内处理 48 个样本的四个时间过程实验，用于成像。我们的协议广泛适用于许多基因和细菌物种。为实验准备盖滑和玻璃滑梯。

使用钳子将盖滑和滑梯放在含有 100% 乙醇的 Coplin 罐中，将罐放在水浴超声波中 15 到 20 分钟。在声波处理结束时，用超纯水清洗滑梯和盖板三到四次，然后用 70% 乙醇重新灌装罐子并重复声波。完成所有声波步骤后，用氮气擦干盖滑和滑动。

将盖子滑入一个空的 1000 微升移液器移液器提示盒中，然后将幻灯片放入干净的滑动盒中。然后，在移液器尖端盒的孔后，使用疏水标记在盖滑上绘制圆圈，并在每个孔上应用 0.1%聚醇 Lysine 的 20 微升降。要建立时间课程实验，将 750 微升从 20 毫升指数级生长的大肠杆菌培养成 1.5 毫升培养管，标记为时间零。

并立即反转管子。使用 0.2 到 1 毫摩尔 IPTG 诱导 lac Z 表达式并启动计时器。检查计时器后，收集每个连续实验时间点的细胞培养，正如刚刚演示的。

在实验期间的适当时间点，在烧瓶中加入五毫摩尔 ONPF 以抑制 lac Z 表达，并继续采样培养物以跟踪 mRNA 降解。在采集时间过程结束时，在室温下孵育样品15分钟，随后在冰上孵育30分钟。在孵化离心机结束时，样品取出固定物，并使用移液器去除上流液。

将细菌重新悬浮在一毫升DEPC PBS中，每次洗涤一毫升新鲜DEPC PBS中再清洗两次细胞。上次洗涤后，将细胞重新悬浮在 30 微升新鲜 DEPC PBS 中。用于细胞的渗透。

首先将每个时间点的样品添加到乙醇灭菌玻璃盖滑单上的单个疏水井中。并允许细胞在室温下用10到30分钟的孵化粘附在盖滑上。在孵化结束时，在每井中加入15微升70%乙醇。

四分钟后，从每口井中吸出乙醇，使油井完全干燥。洗涤后，将30微升的预杂交溶液加入到渗透细胞的每个井中，并在37摄氏度的烤箱中孵育细胞30分钟。将预杂交解决方案替换为每井约 30 微升的探针杂交解决方案。

用铝箔覆盖室内，在37摄氏度的烤箱中孵育两小时。在孵化结束时，使用多通道移液器冲洗井三到五次，每次洗孔时有30微升的洗涤液。上次洗涤后，在37摄氏度下孵育细胞15至30分钟，然后用每次洗涤30微升新鲜DEPC PBS洗井5次。

上次洗涤后，从盖滑中吸出所有液体。并在每井中加入四升新鲜 DEPC PBS。使用钳子小心地将盖滑放在乙醇消毒玻璃滑动样品侧下，并使用硅胶牙龈密封盖滑的边缘。

要定位感兴趣的区域，请选择相位对比度成像的实时模式，并操纵舞台操纵手柄以更改井中的视场。位于一个单元格密度最佳的区域，并调整 Z 焦点，使相位对比度细胞图像处于焦点。然后获取具有 4 秒曝光的 C 5 图像、具有 2 秒曝光的 C 3 图像和具有 0.2 秒曝光的相位对比度图像，每个井大约 10 个不同的区域。

或者，可以运行一个 NDI 采集，其中 C 五、C 三和相位对比度图像是连续采集的。当所有孔都已成像后，打开适当的单元格分割工具，然后取消单击堆栈。加载感兴趣的相位对比度图像并选择独立帧，然后单击计算相位轮廓为零。

开始分割过程，在此期间将识别细胞并计算其轮廓。加载 GitHub 文件夹中提供的参数，然后单击所有帧。在处理结束时选择轮廓以可视化网格。

接下来，在"点检测"选项卡下，取消选中堆栈，检查网格并单击"擦"，以基于两个 D 高斯接头开始现场识别和定量。选择包含荧光图像的文件夹和刚刚从单元格检测过程中计算的网格文件，并指示将点检测结果保存到的文件名。然后使用 GitHub 上提供的图像分析工作流分析荧光图像。

在这个完整的视野中，可以观察到大约500个大肠杆菌细胞，其密度良好，用于细胞分割。相对比图像中细胞的形态应与活细胞的形态保持可比性，以便进行分割。如果细胞过度渗透，它们的形态将变得不适合分割。

由于存在强度高的点，在感应前 lac Z mRNA 点强度的分布与正态分布或泊松分布不配合。当乳酸Z的表达被诱导时，5个正等lacZmRNA的信号在三个正等lacZmRNA信号增加之前增加。如果 lac Z 的表达被抑制，则五个和三个正等 lac Z mRNA 信号会降低。

为了获得转录伸长率，五、三个主要信号的上升与线相拟。而mRNA降解速率是通过拟合衰变区与指数函数获得的。由于单分子鱼是单细胞技术，也可以分析转录中的细胞对细胞变异性。

此外，对五个素数和三个素漆的 Z mRNA 的结肠化分析允许对 lac Z 基因上的 RNA 聚合酶的密度进行量化。由于不同时间点的样本在此过程期间同时处理。在样品在管子和盖滑时保持样品分离非常重要。

使用这种单分子单细胞显微镜技术。研究人员现在可以探索转录和mRNA降解动力学如何与mRNA的绝对数字或亚细胞位置有关。