smFISH é conhecido por medir o número absoluto como localização subcelular de mRNAs. Nosso protocolo sMFISH de duas cores tem a capacidade adicional de medir a cinética da transcrição e a degradação do mRNA. Usando este método, muitas amostras podem ser processadas simultaneamente sem tempo extra ou esforço.
Por exemplo, quatro experimentos de curso de tempo que produzem 48 amostras podem ser processados para imagens em oito horas. Nosso protocolo é amplamente aplicável para muitos genes e espécies bacterianas. Para preparar deslizamentos de cobertura e lâminas de vidro para o experimento.
Use fórceps para colocar deslizamentos de cobertura e slides em um frasco de Coplin contendo 100% de etanol e coloque o frasco em um banho de água ultrassônico por 15 a 20 minutos. No final da sônica lave os slides e cubra deslizes três a quatro vezes com água ultra pura antes de encher o frasco com 70% de etanol e repetir a sônica. Quando todas as etapas de sônica são feitas, seque os deslizamentos de cobertura e deslizes com gás nitrogênio.
Coloque as tampas em uma caixa de ponta de pipeta de 1000 microliter vazia e coloque os slides em uma caixa de slides limpa. Em seguida, seguindo os orifícios da caixa de ponta da pipeta use um marcador hidrofóbico para desenhar círculos nos deslizamentos de cobertura e aplicar uma queda de 20 microliter de 0,1%Poli l lysine para cada um desses poços. Para configurar um experimento de curso de tempo, adicione 750 microliters de uma cultura E.coli de 20 mililitros que crescem exponencialmente para um tubo de cultura de 1,5 mililitro marcado como zero tempo.
E imediatamente inverter o tubo. Induzir a expressão lac Z com 0,2 a um IPTG mililitro e iniciar um temporizador. Depois de verificar o temporizador, colete a cultura celular em cada ponto de tempo experimental consecutivo como apenas demonstrado.
No ponto de tempo apropriado durante o experimento, adicione cinco ONPF milimolares ao frasco para reprimir a expressão lac Z e continue a amostrar as culturas para rastrear a degradação do mRNA. Ao final do curso de tempo aquisição da amostra, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos seguido de incubação no gelo por 30 minutos. No final da centrífuga de incubação as amostras para remover o fixador e usar uma pipeta para remover o supernante.
Suspenda a bactéria em um mililitro de DEPC PBS e lave as células mais duas vezes em um mililitro de DEPC PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, suspenda as células em 30 microliters de DEPC PBS frescos. Para permeabilização das células.
Primeiro adicione a amostra de cada ponto de cada ponto de tempo a poços hidrofóbicos individuais em um dos deslizamentos de tampa de vidro esterilizados com etanol. E permitir que as células aderam ao deslizamento de cobertura com uma incubação de 10 a 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 15 microliters de 70% de etanol a cada poço.
Depois de quatro minutos, aspire o etanol de cada poço para que os poços fiquem completamente secos. Após a lavagem adicione 30 microliters de solução de pré-hibridização a cada poço de células permeabilizadas, e incuba as células por 30 minutos em um forno de 37 graus Celsius. Substitua a solução de pré-hibridização por aproximadamente 30 microliters de solução de hibridização de sonda por poço.
E cubra a câmara com papel alumínio para uma incubação de duas horas no forno Celsius de 37 graus. No final da incubação use uma pipeta multicanal para enxaguar os poços três a cinco vezes com 30 microliters de solução de lavagem por poço por lavagem. Após a última lavagem, incubar as células por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius antes de lavar os poços cinco vezes com 30 microliters de DEPC PBS fresco por lavagem.
Após a última lavagem, aspire todo o líquido do deslizamento da tampa. E adicione quatro microliters de DEPC PBS frescos a cada poço. Use fórceps para colocar cuidadosamente o deslizamento da tampa em um deslizamento de vidro esterilizado com etanol lado para baixo, e use goma dentária de silicone para selar as bordas do deslizamento da tampa.
Para localizar uma área de interesse selecione o modo ao vivo de imagem de contraste de fase e manoe o joystick de palco para alterar o campo de visão dentro de um poço. Localizou uma área em que a densidade celular é ótima e ajustar o foco Z de modo que as imagens das células de contraste de fase estejam em foco. Em seguida, adquira uma imagem C cinco com uma exposição de quatro segundos, uma imagem C três com uma exposição de dois segundos e uma imagem de contraste de fase com uma exposição de 0,2 segundo para aproximadamente 10 áreas diferentes por poço.
Alternativamente, uma aquisição ndi na qual c cinco, C três e imagens de contraste de fase são adquiridas em série pode ser executada. Quando todos os poços tiverem sido imagens, abra uma ferramenta de segmentação celular apropriada e desciclhe a pilha. Carregue as imagens de contraste de fase de interesse e selecione quadros independentes e clique em calcular o perfil de fase como zero.
Para iniciar o processo de segmentação durante o qual as células serão identificadas e seus contornos serão calculados. Carregue os parâmetros fornecidos na pasta GitHub e clique em todos os quadros. No final do processamento selecione contorno para visualizar a malha.
Em seguida, sob a guia de detecção de manchas, desmarcar, verificar malhas e clicar em esfregar para iniciar a identificação e quantificação do local com base no encaixe de dois D Gaussian. Selecione a pasta contendo as imagens fluorescentes e o arquivo de malha que foi calculado a partir do procedimento de detecção de células e indique o nome do arquivo para o qual os resultados de detecção de ponto serão salvos. Em seguida, use o fluxo de trabalho de análise de imagem fornecido no GitHub para analisar as imagens de fluorescência.
Neste campo de visão completo, aproximadamente 500 células E.coli com uma boa densidade para segmentação celular podem ser observadas. A morfologia das células nas imagens de contraste de fase deve permanecer comparável à das células vivas para fins de segmentação. Se as células estiverem mais permeabilizadas, sua morfologia se tornará inadequada para a segmentação.
A distribuição das intensidades de ponto de lac Z mRNA antes da indução não se encaixa bem com uma distribuição normal ou poisson devido à presença de manchas com alta intensidade. Quando a expressão de lac Z é induzida o sinal de cinco prime lac Z mRNA aumenta antes que o sinal de três prime lac Z mRNA aumente. Se a expressão de lac Z for reprimida, os sinais de mRNA Z de cinco e três primeiros lacs diminuem.
Para obter a taxa de alongamento da transcrição, o aumento dos cinco e três sinais primos são adequados com linhas. Enquanto a taxa de degradação do mRNA é obtida pela adequação da região de decomposição com uma função exponencial. Como o peixe de molécula única é uma técnica de célula única, variabilidades celulares a células na transcrição também podem ser analisadas.
Além disso, a análise da colocalização de cinco mRNAs primos e três primeiros lac Z permite quantificar a densidade das polimerases de RNA no gene lac Z. Como amostras de diferentes pontos de tempo são tratadas simultaneamente durante este procedimento. É importante manter a amostra separada enquanto estão nos tubos e no deslizamento da tampa.
Usando esta técnica de microscopia de célula única de uma única molécula. Os pesquisadores agora podem explorar como a transcrição e a cinética de degradação do mRNA estão relacionadas com os números absolutos ou locais subcelulares de mRNAs.
