smFISH ist bekannt für die Messung der absoluten Zahl als subzellulärer Standort von mRNAs. Unser zweifarbiges sMFISH-Protokoll hat die zusätzliche Fähigkeit, die Kinetik der Transkription und mRNA-Degradation zu messen. Mit dieser Methode können viele Proben ohne zusätzlichen Zeit- oder Aufwand gleichzeitig verarbeitet werden.
So können beispielsweise vier Zeitverlaufsexperimente mit 48 Proben für die Bildgebung in acht Stunden verarbeitet werden. Unser Protokoll ist allgemein für viele Gene und Bakterienarten anwendbar. So bereiten Sie Abdeckungsscheine und Glasscheiben für das Experiment vor.
Verwenden Sie Zangen, um Deckelscheine und Rutschen in einem Coplin-Glas mit 100% Ethanol zu platzieren und das Glas in einem Wasserbad Ultraschall für 15 bis 20 Minuten zu platzieren. Am Ende der Beschallung waschen die Rutschen und Abdeckung rutscht drei bis vier Mal mit reinem Randwasser, bevor das Glas mit 70% Ethanol nachgefüllt und die Beschallung wiederholt. Wenn alle Beschallungsschritte abgeschlossen sind, trocknen Sie die Abdeckung rutscht und gleitet mit Stickstoffgas.
Legen Sie die Abdeckung in eine leere 1000 Mikroliter Pipettenkippbox und legen Sie die Dias in eine saubere Schiebebox. Dann, nach den Löchern der Pipettenspitze Box verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um Kreise auf die Abdeckung Slips zu ziehen und einen 20 Mikroliter Tropfen von 0,1%Poly l Lysin auf jede dieser Brunnen auftragen. Um ein Zeitkursexperiment einzurichten, fügen Sie 750 Mikroliter aus einer 20 Milliliter exponentiell wachsenden E.coli-Kultur zu einer 1,5-Milliliter-Kulturröhre hinzu, die mit Derzeit Null gekennzeichnet ist.
Und sofort die Röhre umkehren. Lac Z-Expression mit 0,2 bis einem Millimolaren IPTG induzieren und einen Timer starten. Sammeln Sie nach der Überprüfung des Timers die Zellkultur zu jedem aufeinanderfolgenden experimentellen Zeitpunkt, wie soeben gezeigt.
Zum geeigneten Zeitpunkt während des Experiments fügen Sie dem Kolben fünf Millimolar ONPF hinzu, um die Lac-Z-Expression zu unterdrücken und die Kulturen weiter zu testen, um den mRNA-Abbau zu verfolgen. Am Ende der Zeit Kursprobe Erfassung, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten gefolgt von Inkubation auf Eis für 30 Minuten. Am Ende der Inkubationszentrifugieren Sie die Proben, um das Fixativ zu entfernen und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.
Die Bakterien in einem Milliliter DEPC PBS wieder aussetzen und die Zellen zwei weitere Male in einem Milliliter frischer DEPC PBS pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen in 30 Mikrolitern frischer DEPC-PBS wieder aufhängen. Zur Permeabilisierung der Zellen.
Fügen Sie die Probe zunächst von jedem Zeitpunkt an einzelne hydrophobe Brunnen auf einem der Ethanol-sterilisierten Glasabdeckungsscheine hinzu. Und lassen Sie die Zellen mit einer Inkubation von 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur am Deckschein haften. Am Ende der Inkubation 15 Mikroliter 70% Ethanol zu jedem Brunnen hinzufügen.
Nach vier Minuten das Ethanol aus jedem Brunnen ansaugen, so dass die Brunnen vollständig trocken sind. Nach dem Waschen fügen Sie 30 Mikroliter Vorhybridisierungslösung zu jedem Brunnen von permeabilisierten Zellen, und inkubieren die Zellen für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius Ofen. Ersetzen Sie die Vorhybridisierungslösung durch ca. 30 Mikroliter Sondenhybridisierungslösung pro Brunnen.
Und bedecken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie für eine zweistündige Inkubation im 37 Grad Celsius Ofen. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Brunnen drei- bis fünfmal mit 30 Mikroliter Waschlösung pro Brunnen pro Waschgang zu spülen. Nach der letzten Wäsche die Zellen 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius bebrüten, bevor Sie die Brunnen fünfmal mit 30 Mikrolitern frischer DEPC PBS pro Wäsche waschen.
Nach der letzten Wäsche die gesamte Flüssigkeit aus dem Deckelschlupf absaugen. Und fügen Sie vier Mikroliter frische DEPC PBS zu jedem Brunnen hinzu. Verwenden Sie Zangen, um den Deckelschlupf vorsichtig auf eine Ethanol-sterilisierte Glasrutsche Nachteilen nach unten zu legen, und verwenden Sie Silikon-Zahngummi, um die Ränder des Abdeckungsschlupfes zu versiegeln.
Um einen Interessenbereich zu lokalisieren, wählen Sie den Live-Modus der Phasenkontrast-Bildgebung aus und manövrieren Sie den Bühnen-Joystick, um das Sichtfeld innerhalb eines Brunnens zu ändern. Einen Bereich, in dem die Zelldichte optimal ist, und passen Sie den Z-Fokus so an, dass die Phasenkontrastzellenbilder im Fokus stehen. Dann erfassen Sie ein C-Fünf-Bild mit einer Belichtung von vier Sekunden, ein C-Drei-Bild mit einer Belichtung von zwei Sekunden und ein Phasenkontrastbild mit einer Belichtung von 0,2 Sekunden für ca. 10 verschiedene Bereiche pro Bohrplatz.
Alternativ kann eine NDI-Erfassung ausgeführt werden, bei der C-Fünf-, C-Drei- und Phasenkontrastbilder in Reihe erfasst werden. Wenn alle Bohrungen abgebildet wurden, öffnen Sie ein entsprechendes Zellsegmentierungswerkzeug, und klicken Sie auf den Stapel. Laden Sie die Phasenkontrastbilder von Interesse, wählen Sie unabhängige Frames aus, und klicken Sie auf das Computephasenprofil als Null.
Beginnen Sie den Segmentierungsprozess, bei dem die Zellen identifiziert und ihre Konturen berechnet werden. Laden Sie die im GitHub-Ordner bereitgestellten Parameter, und klicken Sie auf alle Frames. Wählen Sie am Ende der Verarbeitung Kontur aus, um das Netz zu visualisieren.
Als nächstes, unter der Spot-Erkennung Registerkarte, deaktivieren Sie Stapel, überprüfen Sie Netze und klicken Sie auf Reiben, um die Spot-Identifikation und Quantifizierung basierend auf den beiden D Gaußian Fitting zu beginnen. Wählen Sie den Ordner aus, der die fluoreszierenden Bilder und die Netzdatei enthält, die gerade aus dem Zellerkennungsverfahren berechnet wurde, und geben Sie den Dateinamen an, in dem die Spoterkennungsergebnisse gespeichert werden sollen. Verwenden Sie dann den auf GitHub bereitgestellten Bildanalyse-Workflow, um die Fluoreszenzbilder zu analysieren.
In diesem vollen Sichtfeld können ca. 500 E.coli-Zellen mit einer guten Dichte zur Zellsegmentierung beobachtet werden. Die Morphologie der Zellen in den Phasenkontrastbildern sollte für Segmentierungszwecke mit der von lebenden Zellen vergleichbar bleiben. Wenn die Zellen überpermeabilisiert sind, wird ihre Morphologie für die Segmentierung ungeeignet.
Die Verteilung von lac Z mRNA-Spotintensitäten vor der Induktion passt aufgrund des Vorhandenseins von Spots mit hohen Intensitäten nicht gut zu einer normalen oder Poisson-Verteilung. Wenn die Expression von lac Z induziert wird, erhöht sich das Signal von fünf Prime lac Z mRNA, bevor das drei Prim-Lac-Z-mRNA-Signal zunimmt. Wenn die Expression von lac Z unterdrückt wird, nehmen sowohl die fünf als auch drei Prim-Lac-Z-mRNA-Signale ab.
Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu erhalten, ist der Anstieg der fünf und drei Hauptsignale mit Linien geeignet. Während die Rate des mRNA-Abbaus durch Die Anpassung des Zerfallsbereichs mit einer exponentiellen Funktion erreicht wird. Da einzelmolekulare Fische eine Einzelzelltechnik sind, können auch Zell-zu-Zell-Variabilitäten in der Transkription analysiert werden.
Darüber hinaus ermöglicht die Analyse der Kolokalisierung von fünf Prime- und drei Prime-Lac-Z-mRNA die Quantifizierung der Dichte der RNA-Polymerasen auf dem lac Z-Gen. Da Proben aus verschiedenen Zeitpunkten während dieses Verfahrens gleichzeitig behandelt werden. Es ist wichtig, die Probe getrennt zu halten, während sie sich in den Rohren und auf dem Deckelschlupf befindet.
Mit dieser einzelmolekularen Einzelzellmikroskopie-Technik. Forscher können nun untersuchen, wie Transkription und mRNA-Abbaukinetik mit den absoluten Zahlen oder subzellulären Positionen von mRNAs zusammenhängen.
