本文介绍了用透析法和室温原位X射线衍射实验为片上蛋白质结晶开发的微流体芯片的制造方案。这些微芯片的主要优点之一是选择制造材料，使芯片在室温下与原位X射线衍射数据收集兼容。芯片上的结晶实验需要少量的蛋白质样本，从而降低了与这些高价值大分子合作的总体成本。
片上结晶还消除了在常规晶体学实验中经常与低温冷却相结合的易碎蛋白质晶体的手动采集。此外，我们的微芯片使用微透析进行蛋白质结晶，这是一种基于扩散的方法，旨在通过半渗透膜平衡沉淀物浓度，以接近蛋白质结晶的角膜浓度，并能够精确和可逆地控制结晶条件。微透析与温度控制相结合，可用于利用相同的蛋白质样本改变沉淀浓度，从而将核与晶体生长分离，用于研究相图。
首先准备50克PDMS硅胶碱基，并以10比1的质量比例固化剂。将烧嘴中的两种成分与铲子混合。混合后，将混合物放入真空室，以去除所有气泡。
将 25 克预混合 PDMS 放入第一个 SU8 中，以掌握包含微流体通道和柱子的图案，高度可达约 5 毫米。然后将剩余的 25 克 PDMS 倒入第二个 SU8 主，仅包含柱子的图案。在 338 开尔文的烤箱中治疗两个 PDMS 层一小时。
用手术刀在 SU8 大师的图案周围切开固化的 PDMS 层，然后轻轻地从硅胶大师身上剥去 PDMS 模具。将 PDMS 模具置于刚性显微镜玻璃滑梯上，该模具具有通道和柱子的特点，图案朝上。切一小块再生纤维素透析膜，以覆盖 PDMS 模具的中心支柱，该模具设计为蛋白质室。
透析膜的分子重量切口根据蛋白质样本的分子重量和结晶溶液的沉淀物进行相应的选择。然后小心地分离再生纤维素透析膜的干燥部分。切开一小块分离的透析膜。
这块膜的大小取决于芯片的设计。具体来说，这取决于中央支柱的尺寸。将透析膜的一块存放在 PDMS 模具的中央柱子上，该柱子支撑在玻璃滑梯上，其支柱和通道朝上。
然后将第二个 PDMS 模具放在玻璃滑梯上已经支撑的 PDMS 模具顶部，仅具有朝下的柱子。对齐两个 PDMS 模具的所有支柱。再生纤维素透析膜的一块夹在 PDMS 模具的两个中心支柱之间。
制造过程的这一步骤可以在光学显微镜下进行，或者只需仔细观察所有柱子的排列情况即可。将装配件放在真空室中干燥 30 分钟，以消除 PDMS 模具内的困住气泡，并增强可光传 NOA 树脂的插入，此将在本协议的下一步中描述。从真空室中取出组件，用可光粘性硫磺基树脂 NOA 81 通过毛细管化填充两个 PDMS 模具之间的空空间。
在装配的四面中的三面涂抹树脂。将组件置于交叉链接器中，通过暴露在紫外线下 8 秒来治愈 NOA 树脂，使用每平方厘米 35 毫瓦的共化紫外线灯。在显微镜玻璃滑梯的标准尺寸上切下一块 175 微米厚的 PMMA 片，并剥去 PMMA 片件两侧的塑料保护。
完成第一次紫外线暴露后，从底部 PDMS 模具和玻璃滑梯上取出带有部分交叉连接的 NOA 树脂的上部 PDMS 模具。轻轻按压上部 PDMS 模具的组装和 PMMA 片上部分固化的 NOA 树脂。将新组件置于交叉链接器中，通过暴露在紫外线下 60 秒再次治愈 NOA 树脂。
小心去除上部 PDMS 模具。由完全交叉链接的 NOA 树脂制成的透析芯片已准备就绪，该芯片嵌入再生纤维素透析膜，并支持 PMMA 片断。用快速环氧胶在微流体通道的入口和出口点上使用债券市售连接器。
对于流体处理，请根据连接器的大小选择 PTFE 管的直径。该管用于在透析芯片的流体通道内引入结晶溶液。派珀特手动将蛋白质样本滴入位于透析膜上的蛋白质储液库里。
蛋白质液滴的体积取决于正在使用的微芯片的设计。具体来说，这取决于中央柱子的体积，它可以是0.1或0.3微升。小心地在蛋白质库周围涂抹一层薄薄的高真空硅胶油脂。
切一小块PMMA，轻轻地放在硅油脂的薄层之上。切一块卡普顿胶带，大到足以覆盖放置在蛋白质库上方的PMMA片，并粘在NOA芯片上的所有边缘。蛋白质样品封装在储层内，芯片可用于结晶实验。
首先通过混合适量的缓冲器和沉淀溶液，准备大约 500 微升结晶溶液。通过流体连接器在透析芯片点中注入结晶溶液，无论是手动注射器还是自动压力驱动系统。一旦流体通道充满结晶溶液，并且没有空气被困在里面，用Parafilm胶带密封芯片的入口和出口端口。
派珀特蛋白质储液中的蛋白质溶液的适当体积，并封装蛋白质样本，如已经描述的那样。蛋白质晶体生长可以通过数码相机可视化和记录。对于透析微芯片的制造，我们选择了光学透明和生物惰性材料，显示出原位X射线衍射实验的高兼容性。
已评估芯片蛋白质舱构成的材料产生的背景噪声，该材料位于X射线束的直接路径上。蛋白质舱由再生纤维素透析膜、卡普顿胶带和两个PMMA层组成，一层用作微芯片的基板，另一层用于蛋白质样本的封装。在这张照片中，图示了卡普顿胶带产生的背景噪音、再生纤维素透析膜、PMMA 层及其组装。
即使光粘性树脂 NOA 由微芯片的主体组成，但不包括在此测量中，因为它不是蛋白质室的一部分。由于 X 射线与材料的相互作用，可以看到卡普顿胶带的分辨率低于四安格斯特罗姆，PMMA 在四到八安格斯特罗姆之间，透析膜在四到五安格斯特罗姆之间。芯片产生的总背景噪声主要观察到分辨率低于六安格斯特罗姆，表明溶酶高分辨率衍射数据的处理不受影响。
微芯片安装在X射线束前，带有我们为原位X射线衍射实验设计的3D打印支撑，可同时容纳多达三个芯片。进行实验是为了用微透析法评估可溶性蛋白片上结晶的微芯片效率。溶酶晶体生长在293开尔文在两个不同的条件下。
第一个结晶条件包括1.5摩尔氯化钠和0.1摩尔醋酸钠。第二种结晶条件包括一个摩尔氯化钠、0.1摩尔醋酸钠和30%聚乙烯乙二醇400，并选择显示微芯片和微透析方法的兼容性，具有高分子量和粘性溶液的沉淀剂。结晶实验是在静态条件下进行的。
一旦溶酶晶体生长在微芯片上，它们被用于室温下的原位X射线衍射实验。在3D打印支撑的帮助下，微芯片安装在光束线上，并从两个溶酶晶体中收集了完整的X射线衍射数据集。经过X射线衍射数据的处理，以1.95安格斯特罗姆分辨率获得单个溶酶晶体的电子密度图，如图A.图B所示，显示以1.85安格斯特罗姆分辨率获得的电子密度图。
合并从两个不同的溶酶晶体中获取的两个数据集后，两个电密度图都显示详细的结构信息，这些信息可以通过在室温下直接在透析微芯片上进行的原位 X 射线衍射实验从单个或多个蛋白质晶体中获得。我们演示了采用微透析方法为片上蛋白质结晶设计的微流体装置的制造过程，并在室温下进行原位X射线衍射实验。我们使用的制造材料具有很高的X射线透明度，与原位蛋白晶体学兼容。
衍射数据收集是自动化的，使用3D打印支持的芯片，可以直接安装在大分子晶体光束线。这种微芯片的多功能性源于使用微透析来逆向控制结晶条件，以及使用小蛋白质体积绘制相图。设备的原型制作简单明了，在清洁的房间里，一天可以制造多达 30 微芯片，材料相对便宜。
我们预计，这些芯片的这些功能可用于对更具挑战性的蛋白质靶点进行连续X射线晶体学研究。
