小鼠骨髓移植程序研究克隆造血症

我们的协议将帮助研究人员了解三种不同的骨髓移植方法的生理影响，以及它们如何影响克隆造血症设置中的实验结果。全身辐射骨髓移植会对心血管器官产生负面影响，改变疾病发病机理。因此，我们的实验室已经开发了两种替代方法，以尽量减少或避免可能的副作用。

演示程序将是恩比帕克一个研究生，梅根埃文斯博士后研究员，无论是从我的实验室为胸腔和腹部屏蔽，把可调托盘和X射线辐照器在正确的距离，以实现统一的辐照。并将麻醉小鼠放在平底板上，在超平位置相互倒置。用胶带将爪子固定在板上，并将引头屏蔽放置，使下端与西菲斯特纳姆骨对齐，铅盾的上端位于胸腺附近。

屏蔽后，将小鼠放入辐照器中，使动物暴露在两个5.5灰色的辐照下，间隔4至24小时。为了遮挡头部，小心地将鼠标的四只爪子贴在腹部。将鼠标放入锥形约束器中，将约束器滑入铅盾内的插槽中，使鼠标的头部和耳朵完全覆盖，使小鼠身体的其他部位暴露在辐射之下。

屏蔽后，将小鼠放入辐照器中，使动物暴露在4至24小时间隔内分离的5.5个灰色辐射分数。每次放射治疗后，将麻醉小鼠放在加热垫上的笼子里进行监测，直到完全康复。为了隔离骨骼，用70%乙醇对供体小鼠的皮肤进行消毒，并在肋骨笼下方做一个小的横向皮肤切口。

将皮肤紧紧地抱在切口的两侧，朝头部和脚部朝相反的方向撕裂，从所有四肢剥落皮肤。切开肩膀和肘关节，使用实验室擦拭从腐殖质中去除附着的肌肉和结缔组织。小心地脱位股骨和臀部骨骼之间的关节。

并用钝剪刀沿着股骨头切开腿。切开膝盖关节，分离股骨和头骨。并使用实验室湿巾小心地从骨骼中取出附着的肌肉和结缔组织。

然后将同一基因型小鼠的骨骼拉入含有冰上20毫升冰冷无菌PBS的50毫升圆锥管中。要隔离生物安全类二柜中的骨髓细胞，请使用 18 号针头在无菌 500 微升微管底部打一个小孔。并将管子放入含有100微升冰冷无菌PBS的1.5毫升微离心管中。

当所有管子都准备好后，从含有分离骨骼的管中取出 PBS，并将骨骼转移到无菌的 100 毫米细胞培养盘上。使用细钳和小剪刀小心地从每根骨头的末端去除表皮，并将多达六块骨头放入每个500微滑管中。当所有的骨头都被切割后，通过离心提取骨髓细胞。

如果所有骨髓内容都已去除，骨骼应呈白色和半透明，1.5毫升微离心管底部有一个相对较大的红色颗粒。对于骨髓细胞移植，稀释血清中分离的骨髓细胞，将200微升的细胞悬浮物加载到每只小鼠0.5毫升胰岛素注射器中注射。在确认对踏板反射缺乏反应后，慢慢地将整个细胞体积注入每个麻醉接受动物的复古轨道静脉。

然后将一滴丙丙卡因放在眼睛上以缓解疼痛。并允许鼠标在被监视时恢复知觉。比较三种BMT预置方法对供体细胞移植的影响。

在BMT后一个月，通过流动细胞学对周围血液和心脏组织中供体细胞的分数进行了分析。在这项具有代表性的分析中，在接受全身照射的受体小鼠的外周血液中，单核细胞、嗜中性粒细胞和B细胞基本上被消融，取而代之的是供体骨髓衍生细胞的后代。此外，常驻接受者心脏单核细胞和中性粒细胞种群几乎完全被供体衍生细胞所取代。

在部分屏蔽的辐照组中，捐赠者衍生的心脏免疫细胞置换量不大。与接受全身照射的小鼠相比，受助小鼠骨髓细胞在屏蔽区域内的外周血液重组水平较低。在没有BMT预制条件的组中，在BMT之后的四周内，接受者小鼠的周围血液和心脏中可检测出供体衍生细胞。

此外，Tet2缺乏的供体细胞随着时间的推移逐渐扩大。相比之下，受体小鼠与野生类型的供体细胞一起生长，显示出供体细胞的克隆扩张最小。他们优化这些实验模型将使对克隆造血驱动基因进行更严格的研究，这些基因有助于所有导致死亡率，如心代谢疾病和癌症。

我们希望，我们的协议将允许研究人员研究克隆造血症，以研究它如何有助于心血管疾病和其他疾病状态。