骨髓移植平台研究树突状细胞在移植与宿主疾病中的作用

这种新型骨髓移植方案可用于研究宿主树突状细胞在移植后如何调节移植与宿主和移植与白血病反应。外体细胞再生允许此协议通过修改培养条件来适应其他免疫细胞群体（如巨噬细胞和嗜中性粒细胞）的作用。与我展示这个程序的将是实验室经理克里斯塔尔·霍萨克和本科生桑吉耶夫·古尔沙尼。

对于供体T细胞耗尽的C57BL/6骨髓制剂，根据安乐死供体小鼠的标准方案收获股骨和头骨，将骨骼转移到含有1%RPMI培养基的92毫米直径的培养皿中。使用剪刀，从每根骨头上取下两端，用新鲜的 1% RPMI 介质填充一个装有 26 量表针的三毫升注射器。将针头插入一个骨的一端，压压柱塞，将骨髓从腔中冲出并放入收集细胞过滤器中。

收集所有骨髓后，通过75微米网状过滤器将骨髓片段应变，将单细胞悬浮液转移到新的50毫升管中。通过离心沉淀细胞，并在PBS中每毫升浓度的20倍10至6个细胞重新悬浮细胞，并辅以0.5%BSA。接下来，在4摄氏度下，在6个细胞中每10次加入0.05微克THI1抗体，进行30分钟的孵育。

在孵育结束时，用10毫升冰冷PBS洗两次细胞，将颗粒以每毫升浓度的2倍10重新暂停至0.5%BSA的7个细胞，辅以10%幼兔补充剂和2%DNAAse在无菌水中，在37摄氏度下进行45分钟的孵育。在孵育结束时，每次洗涤用15毫升新鲜PBS清洗细胞两次，并在含有0.5%BSA的20毫升PBS中重新暂停颗粒。将淋巴结和脾脏汇集在40微米孔隙过滤器中，并使用注射器柱塞通过过滤器将组织滤芯吸收，以释放细胞。

用RPMI介质用1%FBS进行洗涤，收集所有细胞，通过离心沉淀细胞。向细胞颗粒中加入五毫升的 ACK 解液缓冲液。在室温下五分钟后，停止用5毫升的中量辅以1%FBS的反应，通过离心对白细胞进行颗粒化。

将颗粒重新浓缩在五毫升 MACS 缓冲液中，用于计数，并在新鲜 MACS 缓冲液中将细胞稀释至每毫升 8 个细胞的浓度 2 倍至 8 个细胞。将抗红细胞、抗粒细胞、抗B细胞和抗NK细胞耗竭抗体的浓度适当添加到6个细胞中，在4摄氏度下孵育15分钟。在孵育结束时，用10毫升的冰冷MACS缓冲液清洗细胞，并在新鲜 MACS 缓冲液中每毫升浓度的10倍至8个细胞中重新填充颗粒。

接下来，在6个细胞中加入0.22微升抗生物素微珠，在4摄氏度下混合15分钟孵育。在孵育结束时，使用10毫升冰冷MACS缓冲液洗涤细胞，然后根据标准珠子分离器使用MACSxpress分离器，通过磁珠分离收集未绑定的富T细胞。在分离结束时，通过离心沉淀T细胞，将颗粒重新悬浮在5毫升新鲜MACS缓冲液中进行计数。

为了产生骨髓衍生的树突状细胞，将骨髓从野生型或因子B型敲除小鼠的股骨中分离，并在5毫升的CK解压缓冲液中分离红血球，在5分钟后用10毫升的RPMI和1%FBS补充停止反应。通过离心收集整个血细胞后，将培养基的10毫升中颗粒重新注入每毫升浓度的2倍10至6个细胞，并在每毫升GM-CSF中加入20毫微克，然后将10毫升细胞在37摄氏度的100毫升15毫米培养皿中播种，在6天内将5%的二氧化碳植入体内。第六天，每盘LPS为25微克，激活骨髓衍生的树突状细胞培养物。

至少85%的培养骨髓细胞分化成树突状细胞。磁珠富集后T细胞纯度为90%主要MHC不匹配的C57BL/6 BALB/c模型与移植后GVHD的发展密切相关。严重程度的峰值发生在细胞转移后大约11天，随后临床评分和体重恢复减少，一直持续到第16天。

接受者在移植后30至40天统一屈服于GVHD。有趣的是，具有因子B的带突挖树突状细胞的移植可提高接受者存活率和GVHD临床得分。路西法酶转导A20 B细胞淋巴瘤允许监测活动物的肿瘤生长。

在这个具有代表性的实验中，所有仅接受骨髓的野生BALB/c接受者加上 A20 死于肿瘤复发。野生型BALB/c接受骨髓衍生的ACC1-耗尽的供体T细胞移植后死于GVHD。此外，接受供体骨髓和ACC1耗尽T细胞的动物死于GVHD和肿瘤复发。

为了产生足够的骨髓细胞，在骨髓矫正之前，收集的头骨和股骨必须完全没有肌肉组织。使用生物素酶抗CD3和抗生物素微珠对骨髓细胞进行负纯化，也可以根据手术从骨髓中消耗淋巴细胞。