该协议能够纯化INK T细胞，这是非常罕见的，并允许其数量增加30倍。纯化可以在一天内进行，并在两周内产生大量即用型INK T细胞，用于体内和体外研究。演示该程序的将是实验室的博士后Gloria Delfanti。
解剖小鼠脾脏后，通过70纳米细胞过滤器将其粉碎，以获得10毫升PBS和2%FBS的单细胞悬浮液。以300倍G离心五分钟。除去上清液并用一毫升无菌氯化铵钾赖氨酸缓冲液重悬细胞沉淀。
在室温下孵育细胞三分钟，然后用5毫升PBS和2%FBS阻断。以300倍G离心五分钟。除去上清液后，将细胞沉淀重悬于3毫升PBS中，含2%FBS，并通过移液除去脂肪残留物。
对于富集步骤，保持细胞冷，并使用预冷却在四摄氏度的溶液，然后保持在冰上。以300倍G离心五分钟。用2%FPS和Fc阻滞剂将所有细胞重悬于适量的PBS中，并在室温下孵育15分钟。
每1000万个细胞用一到两毫升MACS分离缓冲液洗涤，并以300倍G离心10分钟。除去上清液后，用CD19-FITC和H2-IAb-FITC染色细胞，并在黑暗中以4至8摄氏度孵育15分钟。通过每1000万个细胞加入一到两毫升MACS缓冲液并以300倍G离心10分钟来洗涤细胞。
除去上清液并将细胞沉淀重悬在每1000万个细胞的90微升MACS缓冲液中。每1000万个细胞加入10微升抗FITC微珠。充分混合，在4至8摄氏度的黑暗中孵育15分钟。
通过每1000万个细胞加入一到两毫升MACS缓冲液来洗涤细胞，并以300倍G离心10分钟。除去上清液，将多达1.25亿个细胞重悬于500微升MACS缓冲液中。将LD柱放置在MACS分离器的磁场中。
为避免堵塞，请在LD柱上应用预分离过滤器，并用两毫升MACS缓冲液冲洗。将细胞悬浮液施加到过滤器上，并收集通过色谱柱的未标记细胞。用一毫升MACS缓冲液洗涤空柱储液器三次。
收集富含T细胞的流出物并计数细胞，保留50微升用于FACS分析。以300倍G离心5分钟后，除去上清液并用CD1d四聚体-PE染色细胞。搅拌均匀，在黑暗中在冰上孵育30分钟。
通过每1000万个细胞添加一到两毫升MACS缓冲液来洗涤细胞。在以300倍G离心10分钟后，除去上清液并将细胞沉淀重悬在每1000万个细胞的80微升MACS缓冲液中。每1000万个细胞添加20微升抗PE微珠。
充分混合，在4至8摄氏度的黑暗中孵育15分钟。通过每1000万个细胞加入一到两毫升MACS缓冲液并以300倍G离心10分钟来洗涤细胞。除去上清液，将多达1亿个细胞重悬于500微升MACS缓冲液中。
根据细胞计数，将LS或MS色谱柱置于MACS分离器的磁场中，并用MACS缓冲液冲洗色谱柱。将细胞悬浮液施加到色谱柱上，收集通过的未标记细胞，并如前所述洗涤色谱柱三次。这是负数。
将色谱柱从磁场中取出，并将其放在新的收集管上。将MACS缓冲液移液到色谱柱上，并将提供的柱塞推入色谱柱中，以冲洗掉富含INK T细胞的阳性组分。为了进一步提高INK T细胞的回收率，将阴性部分以300倍G离心10分钟，然后用新的LS或MS色谱柱重复先前的步骤。
拉动阳性组分并确定细胞计数。保留50微升的正馏分和负组分，用于FACS分析，以检查纯度。要以一比一的比例激活INK T细胞，将适当体积的抗CD3和CD28磁珠转移到管中，并以等体积的PBS，然后涡旋五秒钟。
将试管放在磁铁上一分钟，然后丢弃上清液。从磁体上取下磁管，将洗涤后的磁珠以适当体积的 RPMI 重悬。将纯化的INK T细胞以300倍G离心5分钟，并与小鼠T激活剂抗CD3或CD28磁珠混合。
将一毫升细胞悬浮液，抗CD23和CD28磁珠放在48孔板中，每毫升IL-2有20个单位，然后在37摄氏度下孵育。五天后，每毫升IL-7添加10纳克。当细胞达到80%至90%汇合时，将细胞分成两半，每毫升IL-2始终添加20个单位，每毫升IL-7添加10纳克。
在这些条件下，INK T细胞可以扩增长达15天。使用该协议，INK T细胞通过免疫磁分离过程从转基因小鼠的脾脏中富集。富集后，可以用抗CD3和CD28微球扩增细胞，从而在培养物的第14天平均扩增30倍。
抗CD3和抗CD微球的强激活诱导了细胞表面IMK T细胞TCR表达的下调，并出现了双阴性群体。大多数扩增的INK T细胞是CD4阴性的。谱系特异性转录因子PLZF和ROR γ T的表征使得在第0天和第14天鉴定富集INK T细胞上的NKT1，NKT2和NKT17表型成为可能。
富集的INK T细胞显示出T80样效应子表型，其在扩增14天后是保守的，这可以通过PMA和离子霉素刺激后干扰素γ和IL-4的分泌得到证实。在纯化步骤中，请记住使用预冷却溶液快速工作，并清除移液时可能看到的任何脂肪残留物。扩增的INK T细胞可用于体外测定和体内转移到小鼠中，即使在通过基因转移或编辑进行功能修饰之后也是如此。
INK T细胞的体外扩增克服了匮乏的局限性，使它们可以在肿瘤免疫监测，传染病和自身免疫领域的临床前研究中加以利用。
