Este protocolo permite a purificação de células T ink, que são muito raras, e permite uma expansão de 30 vezes em seu número. A purificação pode ser realizada em um dia e produzir um grande número de células T de tinta prontas para uso para estudos in vivo e in vitro em duas semanas. Demonstrando o procedimento será Gloria Delfanti, uma pós-doutora no laboratório.
Depois de dissecar o baço do mouse, esmague-o através de um coador de células de 70 nanômetros para obter uma única suspensão celular em 10 mililitros de PBS com 2%FBS. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Remova o supernascer e resuspenque a pelota celular com um mililitro de tampão de potássio de cloreto de amônio estéril.
Incubar as células por três minutos em temperatura ambiente, depois bloqueie com cinco mililitros de PBS com 2%FBS. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Depois de remover o supernaspe, resuspenco a pelota celular em três mililitros de PBS com 2% FBS e remova resíduos de gordura por pipetação.
Para os passos de enriquecimento, mantenha as células frias e use soluções pré-resfriadas a quatro graus Celsius e, em seguida, mantidas no gelo. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Resuspenda todas as células na quantidade apropriada de PBS com 2%FPS e Bloqueador de Fc e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Lave com um a dois mililitros de tampão de separação MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Depois de remover o supernascer, colorique as células com CD19-FITC e H2-IAb-FITC e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos.
Remova o supernascer e resuspenja a pelota celular em 90 microliters de buffer MACS por 10 milhões de células. Adicione 10 microliters de microesferas anti-FITC por 10 milhões de células. Misture bem e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius.
Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspend até 125 milhões de células em 500 microliters de buffer MACS. Coloque uma coluna LD no campo magnético do separador MACS.
Para evitar entupimento, aplique um filtro de pré-separação na coluna LD e enxágue-o com dois mililitros de buffer MACS. Aplique a suspensão da célula no filtro e colete as células sem rótulo que passam pela coluna. Lave o reservatório vazio da coluna três vezes com um mililitro de tampão MACS.
Coletar o efluente enriquecido com células T e contar as células, mantendo 50 microliters para análise FACS. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, remova o sobrenaspeuta e manche as células com tetramer-PE CD1d. Misture bem e incubar por 30 minutos no escuro no gelo.
Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células. Após a centrifugação a 300 vezes G por 10 minutos, remova o sobrenascimento e resuspenja a pelota celular em 80 microliters de tampão MACS por 10 milhões de células. Adicione 20 microliters de microesferas anti-PE por 10 milhões de células.
Misture bem e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspende até 100 milhões de células em 500 microliters de buffer MACS.
De acordo com a contagem de células, coloque a coluna LS ou MS no campo magnético do separador MACS e enxágue a coluna com tampão MACS. Aplique a suspensão da célula na coluna, colete células sem rótulo que passam e lave a coluna três vezes como descrito anteriormente. Esta é a fração negativa.
Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta. Tampão MACS pipeta na coluna e empurre o êmbolo fornecido para dentro da coluna para liberar a fração positiva enriquecida em células T de tinta. Para aumentar ainda mais a recuperação da célula INK T, centrifugar a fração negativa a 300 vezes G por 10 minutos e repetir etapas anteriores com uma nova coluna LS ou MS.
Puxe as frações positivas e determine a contagem de células. Mantenha 50 microliters de frações positivas e negativas para análise FACS para verificar a pureza. Para ativar as células INK T em uma proporção de um para um, transfira o volume apropriado de contas magnéticas anti-CD3 e CD28 para um tubo e a um volume igual de PBS, depois vórtice por cinco segundos.
Coloque o tubo em um ímã por um minuto e descarte o supernasce. Remova o tubo do ímã e resuspenda as contas magnéticas lavadas no volume adequado de RPMI. Centrífuga purifica células T de tinta purificada a 300 vezes G por cinco minutos e misture-as com contas magnéticas anti-CD3 ou CD28 do mouse.
Placa um mililitro da suspensão celular, anti-CD23 e contas magnéticas CD28 em uma placa de 48 poços com 20 unidades por mililitro IL-2, em seguida, incubar a 37 graus Celsius. Após cinco dias, adicione 10 nanogramas por mililitro IL-7. Divida as células ao meio quando atingirem 80 a 90% de confluência, sempre adicionando 20 unidades por mililitro IL-2 e 10 nanogramas por mililitro IL-7.
Nessas condições, as células T de tinta podem ser expandidas por até 15 dias. Usando este protocolo, as células T ink são enriquecidas a partir do baço de camundongos transgênicos através de um processo de separação imunomagnética. Após o enriquecimento, as células podem ser expandidas com contas anti-CD3 e CD28, resultando em uma expansão de 30 vezes em média até o dia 14 da cultura.
A forte ativação com contas anti-CD3 e anti-CD induziu a queda da expressão TCR de célulaS T na superfície celular e uma população dupla negativa apareceu. A maioria das células T ink expandidas são CD4 negativos. Caracterização dos fatores de transcrição específicos da linhagem PLZF e ROR gamma T possibilitou identificar os fenótipos NKT1, NKT2 e NKT17 em células T ink enriquecidas nos dias zero e 14.
As células T de tinta enriquecida mostram um fenótipo de efeito t80, que é conservado após 14 dias de expansão, conforme confirmado pela secreção de ambos os interferon gama e IL-4 após PMA e estimulação de ionomicina. Durante as etapas de purificação, lembre-se de trabalhar rápido com soluções pré-refrescadas e se livrar de quaisquer resíduos de gordura que possam ser vistos durante a pipetação. Células INK T expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro e transferências in vivo para camundongos, mesmo após modificações funcionais via transferência ou edição de genes.
A expansão in vitro das células T da TINTA supera a limitação dada pela escassez, tornando-as exploráveis em estudos pré-clínicos nos campos da vigilância imunológica tumoral, doenças infecciosas e autoimunidade.
