循环肿瘤细胞系：基础和转化研究的创新工具

转移是癌症相关死亡的主要原因。当癌细胞从原发肿瘤中分离出来，进入血液循环最终到达远处的靶器官时，就会发生这种现象。一旦这些分离的细胞进入血液，我们称之为继发性肿瘤细胞。

它们代表了一种可变材料，因为一方面，它们是转移形成的罪魁祸首，另一方面，它们比肿瘤活检更容易。事实上，它们可以通过简单的血液穿刺来收集。尽管血液样本中这些细胞的数量很少，但我们是第一个使用3D控制条件从患者血液中建立几种循环肿瘤细胞系的人。

该细胞系可用于任何商业细胞系进行常规实验。例如，用于遗传药物筛选，以感兴趣的蛋白质，也用于体内实验以测试肿瘤的起始能力及其转移潜力。CTC，循环肿瘤细胞系，应在缺氧的3D条件下培养。

一旦CTC形成球体，我们可以将其放入培养基中，并在300 RCF下离心五分钟。弃去上清液并加入500微升Accumax。我们暂停一个，并在37度下孵育溶液20分钟。

然后用PBS洗涤解离的球体并沉淀细胞。用新鲜补充的DMEM / F12重悬沉淀，并在新的24低连接板中看到每微升5个细胞密度的细胞。离心CTC球消除上清液并用PBS洗涤沉淀两次。

在500微升PFE下充分混合，并将管在冰上孵育20分钟。然后，离心固定的球体并用PBS洗涤沉淀两次，消除PBS的最大体积并加入20微升形成的组织凝胶。将其悬浮在培养花瓶上，使其干燥10分钟，然后用手术刀将其分离。

您现在可以处理任何所需的CTC，以靶向所需的目标蛋白质。如前所述，收集 CTC 并将球体与 Accumax 解除关联。除去Accumax并用三mL封闭缓冲液重悬沉沉淀，并通过14微米细胞过滤器转移悬浮液以获得单细胞溶液。

计数细胞并调度到管中，加入200， 000个细胞的体积，离心管并丢弃上清液。根据抗体数据表，在试管中加入抗体的所需体积，并在另一个试管中加入其同种型，并按照制造商的指导继续执行步骤。剩余的管子不会被标记，并且强烈建议在此实验中使用生存能力市场。

在细胞仪上，从未标记的管开始，在负标记区域设置电压。在此之后，放置同种型管。同种型将作为阴性对照，以区分阳性信号和非特异性信号。

并用感兴趣的抗体标记的细胞完成实验，如果感兴趣的蛋白质表达，您应该看到阳性标记的门的变化。该悬浮物中解离的CTC在补充培养基中，密度为每mL200， 000个细胞。在超低附着板96中，孔板，密封50微升的体积并将板在缺氧中孵育24小时。

第二天，加入50微升不同浓度的测试药物，并加入相同体积的DMEM / F12，仅用于进一步确定细胞活力的基础并将板再孵育48小时。在第三天，重新配制试剂并将70微升的混合物加入每个孔中。将板放在轨道振荡器上20分钟，然后测量发光。

该测定是测试大量药物的有用工具，以评估它们对CTC细胞生长的影响。在Eppendorf中，将细胞重悬在100微升PBS中捏住小鼠背部的皮肤，并将针头插入皮肤下方。在同一地点缓慢注射整个体积，并每隔一天监测肿瘤生长，如果肿瘤超过1.5立方厘米的大小，则处死小鼠。

手术前，皮下注射止痛药，在小鼠的背侧腹侧，在第10根肋骨下方做一个小切口。轻轻地将脾脏抬起，放在无菌纱布上。使用胰岛素注射器，在PBS中注射50微升重悬的CTC，等待三分钟而不取出针头。

从一侧固定动脉血管，从另一侧固定静脉血管。然后通过直接在两个结扎体上方切除脾脏。缝合腹膜和皮肤，并对该区域进行消毒。

该实验的目的是测试来自结直肠癌患者的CTC通过诱导可见的转移性预见来定植肝脏的能力。临床肿瘤细胞系的分离和建立是基础研究和转化研究的紧急工具。例如，如果你有一个感兴趣的基因，其中体内研究表明该基因参与结直肠癌细胞系的迁移和侵袭能力，那么在小鼠脾脏注射之前在循环肿瘤细胞系中敲除该基因，让它们定植于肝脏可能是确认您在体内结果的好工具。

对于转化研究，我们分离循环肿瘤细胞系的主要观点是在个性化医疗中使用这种珍贵的材料。从患者的血液样本中，我们将在培养物中分离和扩增CTC两到三周，以便有足够的材料来筛选可用的药物组合并评估其细胞毒性，以最终归因于