גרורות היא הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. תופעה זו מתרחשת כאשר תאים סרטניים מתנתקים מהגידול העיקרי, נכנסים למחזור הדם כדי להגיע סוף סוף לאיבר מטרה מרוחק. ברגע שהתאים המנותקים האלה נכנסים לדם, אנחנו קוראים להם תאים סרטניים משניים.
הם מייצגים חומר משתנה כי מצד אחד, הם האשם העיקרי של היווצרות גרורות וביד השנייה, הם קלים יותר מאשר ביופסיות הגידול. אכן, הם יכולים להיות נאספים על ידי ניקוב דם פשוט. למרות המספר הנמוך של תאים אלה בדגימת הדם, אנחנו הראשונים להקים כמה קו תאים סרטניים במחזור מדמו של המטופל עם דאגה רבה יותר באמצעות מצב מבוקר 3D.
ניתן להשתמש בקו תא זה בכל קו תא מסחרי לניסוי שגרתי. לדוגמה, עבור הקרנת תרופות גנטיות, לחלבון מעניין, אבל גם לניסוי in vivo כדי לבדוק את יכולת החניכה של הגידול ואת הפוטנציאל גרורתי שלהם. CTC, מחזור קווי תאים גידול, צריך להיות תרבית בתנאים 3D היפוקסיה.
ברגע ש-סי.טי.סי יצרו כדורים, נוכל לשים אותו במדיום ולצבוע אותו במשך חמש דקות ב-300 RCF. השלך את supernatant ולהוסיף 500 microliters של Accumax. אנחנו משעים אחד ודגרת הפתרון 20 דקות ב 37 מעלות.
לאחר מכן לשטוף כדורים מנותקים עם PBS ולגלות את התאים. Resuspend הכדור עם DMEM / F12 תוספת טרי ולראות את התאים בצפיפות של חמישה תאים לכל microliter בצלחת חדשה 24 חיבור נמוך. ספירות צנטריפוגה CTCs לחסל את supernatant ולשטוף את הכדור פעמיים עם PBS.
ב 500 microliter של PFE לערבב היטב לדגור על הצינור על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגות הכדורים הקבועים לשטוף את הכדור פעמיים עם PBS, ביטול הנפח המרבי של PBS ולהוסיף 20 microliter של היסטו-ג'ל נוצר. קח את זה להשעיה ולעשות טיפה על אגרטל התרבות, לתת לו להתייבש במשך 10 דקות ולנתק אותו באמצעות אזמל.
עכשיו אתה יכול לעבד עבור כל הרצוי על מנת CTCs מיקוד חלבון הרצוי של עניין. לאסוף CTCs ולנתק את הספירות עם Accumax כפי שתואר בעבר. לחסל את Accumax ו resuspend הכדור עם שלושה מ"ל של חסימת חוצץ ולהעביר את המתלה דרך מסננת תא 14 מיקרומטר כדי להשיג פתרון תא יחיד.
לספור את התאים ולשלוח לתוך צינורות ולהוסיף נפח של 200, 000 תאים, צנטריפוגות הצינורות ולהשליך את supernatant. על פי גיליון נתוני הנוגדנים, הוסף צינור, את הנפח הרצוי של הנוגדן ובצינור אחר האיזוטיפ שלו ולהמשיך את השלבים הבאים בעקבות הנחיית היצרן. הצינור הנותר לא יסומן והשימוש בשוק הכדאיות מוצע מאוד בניסוי זה.
על cytometer, להתחיל עם הצינור שאינו מתויג להגדיר את המתח באזור המסומן שלילית. לאחר מכן, מניחים את צינור האיזוטיפ. האיזוטיפ ישמש כשליטה שלילית כדי להבחין בין האות החיובי לאות לא ספציפי.
ולסיים את הניסוי עם התאים המסומנים עם הנוגדן של עניין שבו אתה צריך לראות שינוי בשער שכותרתו חיובית, אם חלבון העניין בא לידי ביטוי. זה להשעות CTCs מנותקים במדיום בתוספת בצפיפות של 200, 000 תאים לכל mL. בחזקת Ultra Low 96, צלחת טובה, לאטום את הנפח של 50 microliter ולדגירה את הצלחת 24 שעות היפוקסיה.
למחרת, להוסיף 50 microliter של ריכוז שונה של התרופה נבדק ולהוסיף את אותו נפח של DMEM / F12 רק כדי לקבוע עוד יותר את הבסיס של הכדאיות התאית ודגורת הצלחת במשך 48 שעות נוספות. ביום השלישי, ליישב מחדש את הסוכן ולהוסיף 70 microliter של התערובת לתוך כל באר. שים את הלוח על שייקר מסלולית במשך 20 דקות ולאחר מכן למדוד את האור.
בדיקה זו היא כלי שימושי כדי לבדוק מספר רב של תרופות על מנת להעריך את ההשפעות שלהם על צמיחת התא של CTC. באפנדורף, תאים resuspend ב 100 microliter של PBS לצבוט את העור על הגב של העכבר ולהכניס את המחט מתחת לעור. להזריק לאט את כל הנפח באותה נקודה ולעקוב אחר צמיחת הגידול כל יום שני והקרב את העכברים אם הגידול עלה על גודל של 1.5 ס"מ מעוקב.
לפני הניתוח, להזריק תת עורית משכך כאבים, בצד הגב של העכבר, לעשות חתך קטן מתחת לצלע העשירית. מרימים בעדינות את הטחול ומניחים אותו על גזה סטרילית. באמצעות מזרק אינסולין, להזריק 50 microliter של CTCs resuspended ב- PBS ולחכות שלוש דקות מבלי להסיר את המחט.
ליג את כלי העורקים מצד אחד ואת כלי הדם מהצד השני. לאחר מכן להסיר את הטחול על ידי חיתוך ישירות מעל שני קשירות. תפרו את צפק הבטן ואת העור וחטאו היטב את האזור.
מטרת הניסוי הזה היא לבדוק את היכולת של CTCs הנגזר מחולה סרטן המעי הגס ליישב את הכבד על ידי גרימת, ראיית הנולד גרורתית גלויה. בידוד והקמה של קו תאי הגידול של המרפאה הוא כלי מתפתח הן למחקרים יסודיים והן למחקרים תרגומיים. לדוגמה, אם יש לך גן של עניין שבו מחקרי in vivo הראו כי גן זה מעורב נדידה ויכולת פלישה של קווי תאים סרטניים המעי הגס, לדפוק את הגן הזה במחזור קווי תאים הגידול לפני ההזרקה בטחול של עכברים, כדי לאפשר להם ליישב את הכבד עשוי להיות כלי טוב כדי לאשר את התוצאה שלך vivo.
עבור מחקרים תרגומיים, נקודת המבט העיקרית שלנו של בידוד קווי תאים סרטניים במחזור היא להשתמש בחומר יקר זה ברפואה מותאמת אישית. מדגימות הדם של המטופל, היינו מבודדים ומעצימים CTCs בתרבות במשך שבועיים או שלושה על מנת שיהיה מספיק חומר כדי לסנן את פאנל התרופות הזמין ולהעריך את הציטוקסיות שלה סוף סוף לייחס
