我们的协议意义重大，因为它描述了来自原发癌细胞的一代3D肿瘤培养模型，并且该模型比细胞系更能代表现实世界的肿瘤生物学。这种方法适用于多种实体瘤。它也具有成本效益，因为它可以在典型的细胞生物学实验室中从头到尾进行。
使用这种方法生成的3D肿瘤模型支持肿瘤对抗癌疗法或联合疗法的敏感性和耐药性的研究。这种方法从原代癌细胞生成3D模型。因此，它可以确定哪种疗法可能对特定患者有效，从而帮助个性化他或她的治疗。
演示该程序的将是我实验室的博士生Ella Itzhaki。首先，取一个装有单细胞贴壁原代细胞培养物的小T25烧瓶并取出细胞培养基。用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度下加入一毫升1x Accutase三分钟，以制备75%至100%汇合的贴壁原发性肿瘤细胞培养物的单细胞悬液。
通过加入五毫升细胞培养基来中和Accutase溶液。用10毫升血清移液管吸出细胞，并将其沉积在15毫升锥形管中。在室温下以800g离心管5分钟。
取出细胞培养基，在细胞沉淀顶部加入8毫升新鲜细胞培养基，然后轻轻混合。要用血细胞计数器计数活细胞，取50微升细胞悬液的等分试样，并将其与50微升台盼蓝混合。然后计数活细胞，并计算悬浮液中活细胞的总数。
接下来，准备3D培养基。在计算测定所需的细胞数量和所需的总体积后，在200微升的3D培养基中制备具有所需细胞数的细胞悬液。与移液器轻轻混合，以确保均匀分布。
将悬浮液转移到移液槽中，并用多通道移液器将200微升细胞悬液添加到超低附着96孔板的每个孔中。在室温下以300g离心板10分钟以加强细胞的聚集，从而改善细胞聚集，并将板在37摄氏度下在5%二氧化碳加湿的培养箱中孵育。室温下再次以300g离心10分钟后，轻轻除去并丢弃50%的培养基，并加入100微升新鲜的3D培养基以取代现有溶液。
重复此步骤，并将板放回37摄氏度和5%二氧化碳加湿的培养箱中。每隔一到两天在显微镜下检查细胞以监测球体形成。使用成像软件中的缩放工具测量形成的微球的直径。
一旦球体直径达到100至200微米，进行药物功效实验。对于球状体收集，请使用 1， 000 微升移液管从每个孔中收集球体，并将它们沉积到 15 毫升锥形管中。在室温下以300g离心锥形管五分钟，然后小心地吸出并使用移液管弃去上清液。
加入0.5毫升细胞培养基，并轻轻地重悬沉淀。要进行球体计数，请使用 96 孔板并在孔的底部绘制加号，将孔分成象限。向孔中加入50微升悬浮液。
使用10倍物镜，在显微镜下手动计数微球。计算每个象限中的微球，并计算孔中的微球总数。然后通过计数体积将球体计数加倍来计算球体浓度，并计算悬浮液中的微球总数。
在新管中，制备浓度为每200微升细胞培养基200个球状体的球状体悬浮液。对于每种药物治疗，在不同的管中制备球状体储备。通过重复所需的孔数计算每种药物所需的总量，并将药物添加到管中以达到所需的最终浓度。
将200微升球状悬浮液转移到超低附着96孔板的孔中，并将板在37摄氏度下在5%二氧化碳加湿培养箱中孵育。将球状体与研究药物孵育24至72小时后，在室温下以300g离心板5分钟，轻轻除去170微升细胞培养基，在孔底部留下30微升。准备MTT溶液，并向每个孔中加入70微升溶液，最终体积为每孔100微升。
井中的最终MTT浓度为每100微升0.05毫克。此外，用不含细胞的MTT溶液制备空白孔。将板在37摄氏度的5%二氧化碳加湿培养箱中孵育三至四个小时，直到观察到孔中溶液颜色的变化。
当观察到变化时，向每个孔中加入100微升Stop溶液，并轻轻混合孔的内容物而不会产生气泡。在参数ELISA读数器中读取波长为570纳米，背景波长为630至690纳米的板的吸光度。要计算细胞活力，请计算每个孔的特定信号。
然后计算空白孔的平均值，并从每个孔中减去该值。计算包含未用研究药物治疗的细胞的对照孔中特定信号的平均值。最后，计算每个孔中细胞相对于未处理细胞的孔的活力。
此处显示了原代结肠癌细胞培养物通过初始接种细胞的数量随时间形成的球状体。从该图中可以看出，生成的球状体数量取决于最初接种在每个孔中的细胞数量。此处显示了培养10天后来自原代结肠癌细胞的球状体，初始细胞接种为每孔2， 000个。
在结肠癌球体的长期培养后，它们开始相互附着并形成球状体和葡萄状结构的簇，这阻止了均质培养，因此禁止在MTT测定中使用球状体。这里显示了palbociclib，sunitinib及其组合对原发性肿瘤细胞（包括结肠癌和乳腺癌）球状体的影响。对源自结肠和乳腺癌细胞的微球进行了MTT测定。
将MTT信号标准化为来自DMSO处理的细胞的值。这些值表示从 4 到 8 个仿行的均值。在零天和治疗来自结肠癌和乳腺癌细胞的球状体三天后，还显微镜下评估了各种处理对细胞生长的影响。
曲妥珠单抗加长春瑞滨和5氟尿嘧啶加顺铂随时间推移对乳腺癌球状体的影响如图所示。此处显示了球体直径相对于治疗持续时间与零天的变化。每个处理组包括四到六个孔，每个孔中有一个球体。
此处显示了平均变化。球状体是许多研究的重要工具，超越了抗癌治疗的反应。例如，这些研究解决了药物递送甚至细胞间相互作用等基本生物学问题。
使用单细胞悬液开始球状体生成过程至关重要。使用含有 5% 碱性膜指标的介质的超低附着板也很重要。
