使用FlashPack方法进行简单的内部超高性能毛细管柱制造。该程序的目标是引入一种优化的方案，用于LC-MS蛋白质组学分析的快速简便的超高性能毛细管柱填料。现代蛋白质组学基于质谱法与超高性能毛细管液相色谱法相结合。
肽分离主要在内径为75微米的毛细管柱中完成。与商业产品相比，可以在内部准备毛细管柱。定制制备的色谱柱具有类似于商业类比的分离质量，同时节省了大量资金，并允许定制吸附剂和色谱柱尺寸。
在这里，我们演示了内部毛细管柱制造的优化包装程序，我们称之为FlashPack。优化背后的想法是从非常高的吸附剂浆料浓度中包料，同时仍然使用相同的常见100 bar压力炸弹填料设置。这需要连续破碎的吸附剂簇，这些吸附剂簇在高吸附剂浓度下在柱入口周围形成，并防止新的吸附剂材料进入毛细管。
从技术上讲，我们通过使用磁棒作为锤子，不断加热并在吸附剂导线内的毛细管周围移动来实现这一点。正确应用闪存包可将包装率提高多达 10 倍。这使得它适用于包装较软微公制尺寸的超高性能吸附剂，以及在合理的时间内制造长达一米的超长色谱柱。
色谱柱制备过程包括五个步骤。三个准备步骤，包括包装站组装和毛细管和吸附剂浆料的制备。然后，首先将毛细管以60至100巴的压力包装在压力炸弹中。
随后将填充毛细管连接到HPLC系统，在高压下包装吸附剂并柱切割成该尺寸。FlashPack 过程要求在通用协议的步骤 3 和 4 中进行更改。首先，我们准备一个包装站。
它由一个出口压力至少为50巴的氮气罐组成。罐连接到压力炸弹的排气阀，该阀放置在磁力搅拌器中。排气阀的出口通过狭窄的ID PEEK毛细管插入水瓶中，从而可以对减压进行精细控制。
接下来，我们准备毛细管。包装可以在由Kasil和甲酰胺形成的集成玻璃釉料的毛细管中进行包装。另一种选择是包装成由sutter激光拉拔器准备的拉动毛细管。
毛细管必须比预期的柱长10至15厘米。以下视频是以拉动发射器毛细管填料为例准备的。使用切割的凝胶加载移液器吸头保护拉动的发射器端。
有关详细信息，请参阅手稿的文本版本。下一阶段是吸附剂浆料的制备。首先，将约50毫克干吸附剂放入1.5毫升离心管中。
这将是一个库存吸附剂小瓶。本视频是使用Maisch博士的Reprosil Pur C18 AQ 1.9微公制吸附剂编写的。将一毫升甲醇加入储备吸附剂小瓶中。
涡旋10秒。然后在超声处理浴中再超声处理10秒钟。让吸附剂彻底浸泡20至30分钟，然后再次涡旋并超声处理。
准备一个有效的吸附剂小瓶。它必须是一个适合炸弹的锥形底部小瓶。它可以是另一个1.5毫升的离心管或任何其他小瓶，具体取决于特定的压力炸弹设计。
我们使用一个裙边锥形底部螺旋盖管切割到压力炸弹的高度。将吸附剂重新悬浮在储备吸附剂小瓶中，并将500微升与两×三毫米大小的磁铁棒一起转移到工作吸附剂小瓶中。在工作小瓶的顶部加入一毫升甲醇。
让工作小瓶在桌子上静置10分钟，使吸附剂在重力作用下沉降。这一步骤的结果必须是一个锥形的底部小瓶，底层的松散吸附剂高约四毫米。如果层太低，则从库存小瓶中吸收更多的吸附剂。
因此，制备的工作小瓶用于数月时间内的多个色谱柱的制备。如果工作吸附剂小瓶在不搅拌的情况下停留超过两个小时，则必须在包装前再次通过重力涡旋，超声处理并沉降。当一切准备就绪后，进入第四阶段，装入压力炸弹。
使用熔融石英毛细管和压力炸弹时，请始终佩戴防护眼镜。同时，不建议戴防护手套。它们严重降低了正确处理小直径毛细管所需的触觉，并导致错误。
将吸附剂小瓶放入压力炸弹中，并紧紧固定所有结。以每分钟60至100发的速度开始旋转，将熔碎或拉动的发射器毛细管插入炸弹。将其推到小瓶的最底部，然后将其向上抬起两到三毫米并固定结。
施加最小的所需力来固定毛细管。检查毛细管是否正确固定。用手拉出毛细管一定是不可能的。
非常缓慢地打开压力弹阀，同时保持毛细管的开口端远离您的脸。观看包装过程的初始步骤。加压后，吸附剂立即充满毛细管，并且在整个长度上变得不透明。
一旦吸附剂开始在远端内包装，背压增加，流量减慢，毛细管内的均匀吸附剂浆液改造成几个吸附剂包，由无吸附剂间隙隔开。已经填充的吸附剂可见为颜色浓密的持续生长区域。在整个包装过程中，保持吸附剂填充区域至少为毛细管长度的70%，并留有小的无吸附剂间隙。
在包装过程中需要注意几个常见问题。它们需要在飞行中进行设置调整，以保持向毛细管中高效输送吸附剂。最常见的问题是当新的吸附剂停止进入毛细管时，而已经存在的吸附剂仍在移动。
在大多数情况下，毛细管入口被自聚集的吸附剂簇阻塞。逐个应用这些步骤，直到吸附剂流恢复，然后跳过其余与问题相关的步骤。将转速提高到每分钟 500 发，并立即将其降低到 60 RPM。
大多数时候，它恢复吸附剂流动。检查包装过程其余部分的转速是否至少为 60 RPM。如果它没有帮助，请短暂地发泄包装炸弹并立即将其加压。
如果它没有帮助，或者再次发生阻塞，请将毛细管重新定位在吸附剂层内。没有吸附剂可能是由于毛细管开口端在磁力棒上方太高，因此柱端不接触它。或者毛细管位置太低并粘入小瓶底部。
首先，将炸弹完全通风，然后松开螺母，将毛细管推到底部，然后将其向后拉两毫米。固定螺母。打开阀门对炸弹加压并继续包装。
有关打包问题的更多详细信息，请参阅该方法的文本版本。继续包装色谱柱，直到达到目标色谱柱长度加上五到七厘米。停止旋转，非常缓慢地给炸弹减压。
稍微打开炸弹阀，等待水瓶内的气泡破裂消退。然后将阀门打开一点，再次等待气泡破裂减慢。因此，在增量步骤中，释放压力，直到没有气体从阀门中流出。
不要一次完全打开阀门。它会导致毛细管内部冒泡，吸附剂会回到小瓶中。如果发生这种情况，请向炸弹加压，等待柱子再次装满。
当气体停止从排气阀中流出时，将填充的毛细管从压力炸弹中取出。不要让色谱柱变干。如果未立即连接到HPLC系统以进行进一步包装，请将包装好的毛细管全部浸入10%乙醇溶液中储存。
断开连接的HPLC色谱柱以相同的方式存储。如果今天没有计划再包装，请从炸弹中取出吸附剂小瓶并紧紧关闭。将其保存以进一步包装柱。
第五阶段，高效液相色谱打包。通过 HPLC 连接将填充的毛细管连接到 HPLC 系统。开始高有机溶剂的流动。
根据包装长度调整流量，目标约为 300 巴。对于40厘米包装的毛细管，使用每分钟200-300正常升的流速。注意正在包装的毛细管内是否有松散的吸附剂，从而增加总包装长度。
在不停止流动的情况下，将柱体浸入超声处理浴中两次。重要的是只浸没柱体的一部分。不要浸没柱端和毛细管连接。
当吸附床停止收缩时，将柱体浸入超声处理槽中两倍而不停止流动。在 300 根柱线处再运行 10 分钟。停止流动，等待压力降至三巴以下，然后断开色谱柱。
目视检查色谱柱是否有间隙和变色。如果发现任何，可以在流动下重复超声处理。对于关键实验，请考虑制作一个新列。
将列剪切到所需的长度。正确完成的切割是色谱柱效率的先决条件。用划线器在聚酰胺涂层中做一个缺口。
部分裂开毛细血管，并将两块拉开。在陶瓷晶圆上或用研磨膜抛光柱前端。使用超高压连接将色谱柱重新连接到LC系统。
工作流量从2%B开始，根据色谱柱参数调整工作流量。例如，100微米ID柱以每分钟500纳升的速度运行。
等待压力平衡并检查色谱柱背压。正确制备的色谱柱可提供与其长度和吸附剂特性成比例的背压。例如，装有两微米吸附剂的30厘米毛细管柱在2%溶剂B下具有450至500巴的背压。如果生产的色谱柱在预期范围内提供背压，则随时可以使用。
如果背压远超出预期范围，则柱子或LC系统出现问题。使用FlashPack包装可在100巴包装压力下在不到一小时的时间内用1.9微米吸附剂生产出50厘米的毛细管包装。例如，我们生产30厘米100微米ID超高压柱，装入带有1.9微米ReprosilPur C18 AQ吸附剂的拉制发射器毛细管中。
包装是在60巴处完成的，装入50厘米长的拉动发射器毛细管中。毛细管在40分钟内被包装到40厘米，毛细管内有一些更多的吸附剂没有包装。将填充的毛细管连接到HPLC系统，并用溶剂B以每分钟300纳升的速度运行，溶剂B在我们的例子中是80%乙腈，0.1%甲酸。
最终包装长度为43厘米。柱子被切成30厘米。在99%溶剂B下每分钟工作500纳升时，塔的背压为275巴，接近预期值。
为了测试该柱，我们在2-50%B的15分钟梯度中分离了50 fmol的细胞色素C蛋白胰蛋白酶切。平均FWHM约为三秒。
所描述的协议能够在合理的时间内在常见的100 bar包装中生产UHPLC色谱柱。短HPLC或UPLC色谱柱可在几分钟内装填，而30-50厘米长色谱柱可在不到一小时的时间内装填。该方法可有效地将含有RP和任何其他化学物质的吸附剂包装到任何列ID中。
生产的色谱柱与任何其他具有类似尺寸和吸附剂参数的商业色谱柱一样可重复地有效。
