ייצור עמוד נימי פשוט בעל ביצועים גבוהים במיוחד עם גישת FlashPack. מטרת הליך זה היא להציג פרוטוקול ממוטב לאריזת עמודות נימיות מהירה וקלה במיוחד לביצועים גבוהים עבור ניתוח פרוטאומיקה של LC-MS. פרוטאומיה מודרנית מבוססת על ספקטרומטריית מסה בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית נימית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד.
הפרדת פפטיד נעשית בעיקר בעמודים נימיים בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר. בדומה למוצרים מסחריים, ניתן להכין עמודים נימיים בתוך הבית. עמודות שהוכנו בהתאמה אישית מדגימים איכויות הפרדה הדומות לאנלוגיות מסחריות, תוך חיסכון בכסף רב ומאפשרות התאמה אישית של סורבט וגודל עמודה.
כאן אנו מדגימים הליך אריזה ממוטב לייצור עמודות נימיות בתוך הבית, שאנו מכנים FlashPack. הרעיון מאחורי האופטימיזציה הוא לארוז מריכוז גבוה מאוד של תפיחה, תוך שימוש באותה הגדרת אריזת פצצת לחץ 100 בר נפוצה. זה דורש פירוק מתמשך אשכולות סורבט, אשר נוצרים סביב הכניסה לעמוד בריכוז סורבנט גבוה ולמנוע חומר סורבט חדש מלהיכנס נימי.
מבחינה טכנית, אנו משיגים זאת באמצעות מוט מגנט כפטיש, כל הזמן מתחמם ומסתובבים סביב נימי בתוך חוט סורבט. FlashPack מיושם כראוי מגדיל את שיעור האריזה עד 10 פעמים. זה עושה את זה מתאים לאריזת sorbents ביצועים גבוהים במיוחד בגודל מיקרו רך יותר שהופך את הייצור עמודות ארוכות מאוד עד אורך מטר בזמנים סבירים.
הליך הכנת העמודות מורכב מחמישה שלבים. שלושה שלבי הכנה, הכוללים הרכבת תחנת אריזה והכנת ריר נימי וסורבט. ואז נימי הוא ארוז הראשון בפצצת הלחץ בלחץ בר 60 עד 100.
לאחר מכן, חיבור של נימי ארוז למערכת HPLC, אריזת sorbent בלחץ גבוה וחיתוך עמודה לגודל. הליך FlashPack דורש לבצע שינויים בשלבים 3 ו-4 של הפרוטוקול המשותף. קודם כל, אנחנו מכינים תחנת אריזה.
הוא מורכב ממיכל דלק חנקן עם לחץ שקע של לפחות 50 ברים. המיכל מחובר שסתום האוורור של פצצת הלחץ, אשר ממוקם stirrer המגנטי. השקע של שסתום האוורור מוכנס לתוך בקבוק מים דרך נימי PEEK מזהה צר, המאפשר שליטה עדינה על הפחתת לחץ.
לאחר מכן, נכין נימי. אריזה יכולה להיעשות או לתוך נימי fritted עם פריט זכוכית משולב שנוצר מ Kasil ו formamide. אפשרות נוספת היא לארוז לתוך נימי משך מוכן על ידי מושך לייזר סאטר.
יש ליצור את הנימי 10 עד 15 ס"מ יותר מאורך העמודה המיועד. הסרטון הבא מוכן על הדוגמה של אריזת נימים פולט משך. הגן על קצה פולט משוך עם קצה פיפטה חתוך לטעינת ג'ל.
לקבלת פרטים, עיין בגירסת הטקסט של כתב היד. השלב הבא הוא הכנת סורבטים. ראשית, לשים סביב 50 מיליגרם של סורבט יבש לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
זה יהיה מקטורן סורבט מניות. וידאו זה הוכן עם השימוש Reprosil Pur C18 AQ 1.9 מיקרו סורבט מטרי מד"ר Maisch. הוסף מיליליטר אחד של מתנול לתוך מקטורן סורבט המניה.
מערבולת ל-10 שניות. וסוניקאט באמבט sonication לעוד 10 שניות. תן סורבט להשרות ביסודיות במשך 20 עד 30 דקות, ואז מערבולת sonicate אותו שוב.
הכן מקטורן סורבט עובד. זה חייב להיות מקטורן תחתון חרוט שמתאים לפצצה. זה יכול להיות עוד צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר או כל בריון אחר בהתאם לעיצוב פצצת הלחץ המסוים.
אנחנו משתמשים בצינור כובע בורג תחתון חרוט חתוך לגובה של פצצת הלחץ. להשעות מחדש את sorbent בבילוחן sorbent המלאי ולהעביר 500 microliters לתוך מקטורן סורבט עובד יחד עם מוט מגנט שניים על שלושה מילימטרים גודל. למעלה ללוויאל העובד למיליליטר אחד עם מתנול.
תן לפועל העובד לעמוד על השולחן במשך 10 דקות כדי שהסורבנט יתיישב בכוח המשיכה. התוצאה של שלב זה חייבת להיות בון תחתון חרוט עם השכבה התחתונה של סורבט רופף סביב ארבעה מילימטרים גבוה. אם השכבה נמוכה מדי, ועוד קצת סורבטים ממכבינת המניות.
כך מכינים את מקטוריון העבודה המיועד להכנה של עמודות מרובות לאורך חודשים. אם סורבט בוחן עובד נשאר מבלי לערבב במשך יותר משעתיים, זה חייב להיות מערבולת, sonicated ויישב על ידי כוח המשיכה שוב לפני האריזה. כשהכל מוכן, המשיכו לשלב הרביעי, ארזו את פצצת הלחץ.
תמיד להרכיב משקפי מגן בעת עבודה עם נימי סיליקה מותכים ואת פצצת הלחץ. יחד עם זאת, כפפות מגן אינן מומלצות. הם מפחיתים מאוד את תחושת המגע הנדרשת לטיפול נכון בנימים בקוטר קטן ומובילים לטעויות.
מניחים את מקטורן סורבט לתוך פצצת הלחץ ולתקן את כל הקשרים בחוזקה. התחל את הסיבוב ב 60 עד 100 סיבובים לדקה, הכנס את נימי פולט fritted או משך לתוך הפצצה. לדחוף אותו לתחתית של הקרבון, ולאחר מכן להרים אותו שניים עד שלושה מילימטרים ולתקן את הקשר.
החל כוח נדרש מינימלי כדי לתקן את נימי. תבדוק שהניני נימי מתוקן כראוי. זה חייב להיות בלתי אפשרי להזיז את הנימי על ידי משיכת אותו ביד.
לאט מאוד, לפתוח את שסתום פצצת הלחץ תוך שמירה על הקצה הפתוח של נימי הצביע הרחק מהפנים שלך. צפה בשלבים הראשוניים של תהליך האריזה. מיד עם לחץ, sorbent ממלא את נימי וזה הופך להיות לא שקוף לכל אורך.
ברגע שהסורבנט מתחיל להיארז בתוך הקצה הדיסטלי, הלחץ האחורי עולה, הזרימה מאטה וההתרפקות הסורבת אפילו בתוך הרפורמות הנימיות למספר מנות סורבט, מופרדות על ידי פערים חופשיים סורבטים. סורבט שכבר ארוז נראה כאזור בצפיפות הגדל ברציפות. שמור על האזורים המלאים sorbent להיות לפחות 70% של אורך נימי עם פערים קטנים ללא סורבט במשך כל משך תהליך האריזה.
ישנן מספר בעיות נפוצות לצפייה במהלך תהליך האריזה. הם דורשים כוונון התקנה בטיסה כדי לשמור על משלוח סורבט יעיל לתוך נימי. הבעיה השכיחה ביותר היא כאשר sorbent חדש מפסיק להיכנס נימי בעוד sorbent כבר בפנים ממשיך לנוע.
ברוב המקרים, הכניסה נימי נחסמת על ידי אשכולות סורבטים צבירה עצמית. החל שלבים אלה בזה אחר זה עד לחזרת זרימת הסורבנט ולאחר מכן דלג על שאר השלבים הקשורים לבעיה. הגדל את מהירות הסיבוב ל- 500 סיבובים לדקה, והפחת אותה מיד בחזרה ל- 60 סל"ד.
רוב הזמן זה משחזר את זרימת הסורבט. בדוק את מהירות הסיבוב להיות לפחות 60 סל"ד למשך שאר תהליך האריזה. אם זה לא עוזר, לפרוק בקצרה את פצצת האריזה ומיד ללחוץ עליו בחזרה.
אם זה לא עוזר, או החסימה קורה שוב, למקם מחדש את נימי בתוך שכבת sorbent. היעדר הסורבט יכול להיות בגלל הקצה הפתוח נימי להיות גם גבוה מדי מעל סרגל המגנט, כך קצה העמודה לא לגעת בו. או שהניני נימי ממוקם נמוך מדי ונדבק לתחתית של הוויאל.
ראשית, לפרוק את הפצצה לחלוטין, ואז לשחרר את האגוז, לדחוף את נימי לתחתית, ולאחר מכן למשוך אותו שני מילימטרים אחורה. תקן את האגוז. פתח את השסתום כדי ללחוץ על הפצצה ולהמשיך לארוז.
פרטים נוספים על בעיות האריזה מתוארים בגירסת הטקסט של השיטה. המשך לארוז את העמודה עד להשגת אורך עמודת היעד בתוספת חמישה עד שבעה סנטימטרים. עצור את הסיבוב ולאט לאט להוריד את הפצצה.
פתחו מעט את שסתום הפצצה וחכו לפיצוץ הבועה בתוך בקבוק המים כדי להתפוגג. ואז לפתוח את השסתום קצת יותר רחב ושוב לחכות פרץ הבועה להאט. לכן בצעדים מצטברים, לשחרר את הלחץ עד שום גז יוצא של השסתום.
אל תפתח את השסתום בבת אחת. זה יוביל לבעבע בתוך הנימי והסורבט חוזר לתוך הקרבון. אם זה יקרה, לחץ על הפצצה בחזרה וחכה שהטור ייארז שוב.
כשהגז יפסיק לצאת מ שסתום האוורור, תוציא את הנימי הארוז מפצצת הלחץ. אל תיתן לעמוד להתייבש. אם אינך מחובר למערכת HPLC באופן מיידי להמשך האריזה, הכנס את הנימי הארוז לאחסון על-ידי שקיעתה בשלמותה לפתרון אתנול של 10%.
עמודות HPLC מנותקות מאוחסנות באותו אופן. אם לא מתוכננת אריזה נוספת להיום, הוציאו את מקטורן הסורבט מהפצצה וסגרו אותו בחוזקה. שמור את זה להמשך אריזת העמודות.
שלב חמש, HPLC אריזה. חבר את הנימי הארוז למערכת HPLC באמצעות חיבור HPLC. התחל את הזרימה של ממס אורגני גבוה.
התאם את הזרימה בהתאם לאורך האריזה המתמקד סביב 300 פסים. עבור 40 ס"מ ארוז נימי להשתמש בקצב הזרימה של 200-300 ליטר רגיל לדקה. שימו לב לסורבט רופף בתוך הנימי שנארז, מה שמוסיף לאורך האריס הכולל.
מבלי לעצור את הזרימה, טובלים את גוף העמוד פעמיים באמבט sonication. חשוב לטבול רק חלק מגוף העמודה. אל תטבול קצות עמודה וחיבורים נימים.
כאשר מיטת הסורבט מפסיקה להתכווץ, טובלים את גוף העמוד באמבט sonication פעמיים יותר מבלי לעצור את הזרימה. הפעל את העמודה במשך 10 דקות נוספות ב- 300 עמודות. עצור את הזרימה, המתן ללחץ לרדת אל מתחת לשלוש עמודות ולנתק את העמודה.
בדוק חזותית את העמודה עבור היעדר פערים ושינויי צבע. אם יימצאו כאלה, ניתן לחזור על sonication מתחת לזרימה. לניסויים קריטיים, שקול ליצור טור חדש.
גזור את העמודה לאורך הרצוי. חיתוך שנעשה כראוי הוא תנאי מוקדם ליעילות העמודות. הפוך חריץ בציפוי פוליאמיד עם הסופר.
לפצח חלקית את נימי, ולמשוך שתי חתיכות זה מזה. ללטש את הקצה הקדמי של העמודה על רקיק קרמיקה או עם סרט מלטפים. התחבר מחדש את העמודה למערכת ה- LC באמצעות חיבור בלחץ גבוה במיוחד.
התחל את קצב זרימת העבודה ב- 2%B. קצב זרימת העבודה מותאם בהתאם לפרמטרים של עמודה. לדוגמה, 100 עמודות מזהה מיקרומטר מופעלות ב- 500 ננו-לייטר לדקה.
חכה ללחץ כדי שיווי משקל ולבדוק את הלחץ האחורי בעמודה. טור מוכן כראוי נותן לחץ בחזרה פרופורציונלי לאורכו ומאפייני סורבט שלה. לדוגמה, עמוד נימי בגודל 30 ס"מ עמוס בשני מיקרומטרים סורבט יש לחץ אחורי של 450 עד 500 פסים ב- 2%B ממס. אם העמודה המיוצרת נותנת לחץ אחורי בטווח הצפוי, היא מוכנה לשימוש.
אם הלחץ האחורי הוא הרבה מחוץ לטווח הצפוי, משהו לא בסדר או עם העמודה או עם מערכת LC. אריזה עם FlashPack מייצר נימי ארוז עבור 50 ס"מ עם 1.9 מיקרומטר sorbent בפחות משעה אחת בלחץ אריזה 100 בר. כדוגמה, אנו מייצרים 30 ס"מ 100 מיקרומטר מזהה עמוד בלחץ גבוה במיוחד ארוז לתוך נימי פולט משך עם 1.9 מיקרומטר ReprosilPur C18 AQ sorbent.
האריזה נעשתה ב-60 סורגים לתוך נימי פולט באורך 50 ס"מ. הנימי היה ארוז עד 40 ס"מ ב 40 דקות עם עוד כמה סורבט בתוך נימי לא ארוז. נימי ארוז היה מחובר למערכת HPLC ולהפעיל ב 300 nanoliters לדקה עם ממס B, אשר במקרה שלנו היה 80%acetonitrile, 0.1% חומצה פורמית.
האורך הארוז האחרון היה 43 ס"מ. העמוד נחתך 30 ס"מ. ב 500 ננו-ליטres לדקה עבודה זרימה עם 99% ממס B העמודה נתנה את הלחץ האחורי של 275 פסים, אשר קרוב לערך הצפוי.
כדי לבדוק את העמודה, הפרדנו 50 fmol של תקציר טריפטי של חלבון ציטוכרום C בשיפוע של 15 דקות מ 2-50%B. פסגות כרומטוגרפיות היו סימטריות מאוד עם מעקב מינימלי. FWHM הממוצע היה סביב שלוש שניות.
הפרוטוקול המתואר מסוגל לייצר עמודות UHPLC באריזה משותפת של 100 עמודות שהוגדרו בזמן סביר. עמודות HPLC או UPLC קצרות ניתנות לארז תוך דקות, בעוד עמודות ארוכות של 30-50 ס"מ ארוזות בפחות משעה. השיטה יעילה לאריזת סורבנטים עם RP וכל כימיה אחרת בכל מזהה עמודות.
עמודות המיוצרות יעילות באופן רב כמו כל עמודה מסחרית אחרת בגודל דומה ופרמטרים סורבטים.
