超高频超声成像分析黑色素瘤Braf/Pten基因工程小鼠模型中的淋巴结体积

我们的方法可以通过测量腹股沟淋巴结体积的增加来监测腹股沟淋巴结转移性受累的增加。这种非侵入性方法的耐受性非常好，因此，可以在两周内对同一实验动物安排多次成像。该方法非常适合评估药物治疗对转移性疾病的影响。

我们将这种方法应用于Braf / Pten黑色素瘤模型，但原则上，它可以用于评估各种药物在转移性癌症的各种临床前小鼠模型中的疗效。演示该程序的将是我实验室的博士后Marianna Vitiello博士和IFC-CNR研究员Claudia Kusmic博士。对于黑色素瘤诱导，连续三天在上背部约一平方厘米的剃须皮肤上涂抹三微升五毫摩尔4-羟基他莫昔芬。

皮肤涂漆六周后，使用卡尺测量原发性肿瘤的体积，并最终测量皮下转移的体积。然后，使用超声成像来测量腹股沟淋巴结的体积。通过目视检查分析原发肿瘤和淋巴结后，切除它们以进行组织学研究。

确认麻醉后，将动物转移到超高频超声成像站的加热板上，将动物保持在仰卧位置。使用用凡士林润滑的直肠探头调节板温度，将小鼠的体温保持在生理范围内。用导电膏涂覆前爪和后爪，并用胶带将其贴在嵌入板中的ECG板电极上。

检查生理参数是否正确获取和显示。通过施用脱毛剂去除腹股沟区域的毛发，并用声耦合介质涂覆它们。然后，将超高频超声线性探头夹在嵌入成像站中的专用3D电机中，允许探头的自动和逐步移动。

正确定位并调整超声探头的位置，以获得腹股沟淋巴结的短通图像，并将感兴趣区域置于焦点区域。将扫描距离设置为 2 到 5 毫米，步长设置为 44 微米，结果每个淋巴结切片 46 到 114 个扫描步长，每只动物的采集时间为 1 到 3 分钟。扫描腹股沟淋巴结的整个体积作为2D B模式图像序列，通过以微米级阶梯大小的换能器的线性运动来获取多个级别的图像，以生成呼吸和心脏门控电影回路方面的3D数据。

成像后，以原始格式以数字方式存储采集的图像，以便进一步离线分析。对于超声图像的后处理，打开3D腹股沟淋巴结图像的数据集，选择多切片方法并按“开始”按钮，以可视化当前帧以及与3D采集期间捕获的每个图像相对应的所有帧的缩略图。选择淋巴结明显的第一帧的缩略图，以将其加载到轮廓视图中。

在轮廓视图中，左键单击鼠标以沿淋巴结边界放置点。设置所需点数后，右键单击以完成轮廓。完成第一个轮廓后，使用缩略图视图选择要轮廓的下一个图像。

如果需要，请在轮廓之间跳过多个图像，以减少每个 3D 体积所需的手动迹线数。重复此过程，直到整个卷被勾勒出来，然后单击“完成”。在 3D 模式窗口工作区中，单击图像显示区域下方的体积测量图标以可视化淋巴结体积的数值，并通过淋巴结体积的 3D 渲染激活表面视图。

用4-羟基他莫昔芬治疗小鼠诱导CreER酶活性，导致基因组水平从野生型Braf到突变的Braf V600E的转换，而Pten则丢失。4-羟基他莫昔芬治疗后四周，原发性肿瘤达到50至100立方毫米的体积，并且可以通过卡尺再测量两周的生长，从而显示腹股沟淋巴结中观察到的色素沉着逐渐增加。黑色素沉积总是由于转移的黑色素瘤细胞的存在，正如黑色素瘤抗原黑色素A和Braf V600E的免疫组织化学染色所证实的那样。

在分割阶段结束时，所有部分都显示了淋巴结外部轮廓的叠加。这里显示了在4-HT治疗后4周，5周和6周分析的右腹股沟淋巴结的3D渲染图。同一动物的左腹股沟和右腹股沟淋巴结体积随时间推移的增加也被量化。

建议将超声成像与适当的免疫组织化学染色相结合，以便在分子水平上确认癌细胞的存在。除淋巴结外，还可以使用超声成像随时间监测皮下转移的体积。如果两周的时间范围太短而无法理解所研究药物的作用，请选择更外周的诱导位点或不太容易发生肿瘤的基因型。