该程序的目的是通过纯位移 NMR 分析植物提取物。以下方案包括从不同植物基质、香草叶、马铃薯块茎和开普醋栗果实制备样品的关键方面，以及记录最佳纯位移心理和 SAPPHIRE 心理谱图的详细分步 NMR 程序。质子 NMR 的代谢分析是一门技术，它分析复杂生物混合物的 NMR 波谱中无数信号中的信号，目的是识别该混合物中的每种代谢物。
目的是描述可能与化学分类学、表型、感官特性、原产地名称、代谢反应以及植物科学其他重要领域相关的生物标志物。质子 NMR 通常用于代谢分析。然而，大量具有扩展多重性的信号局限在狭窄的乘积光谱范围内，导致广泛的重叠，使光谱的分析和解释复杂化。
通常，单个谐振的宽度范围为 1 到 5 赫兹。然而，高度耦合的信号可以在 25 赫兹甚至 50 赫兹的范围内传播，从而增加信号重叠的可能性。为了克服这一限制，我们应用现代纯位移 NMR 方法来宣布三种不同工厂场景中的波谱分辨率，如此处所示。
样品制备、植物提取物制备可以通过多种方式进行，程序将取决于基质。首先将开普醋栗果实均质化成果汁。香草叶完好无损地使用，土豆切片以防止氧化。
在所有情况下，材料都经过冻干、研磨，然后提取。对于开普醋栗果实和马铃薯，用水进行萃取，超声处理辅助。离心回收上清液，任何液体均经冻干或速真空干燥。
将干燥的提取物重悬于草酸盐缓冲液中，蒸发至干，并重新溶解在含有 TMSP 的 D2O 中。在香草的情况下，使用含有 TMSP 和氘代甲醇的氘代磷酸盐缓冲液直接提取。离心回收上清液。
所有样品均通过 PTFE 针式过滤器过滤，NMR 管中填充 0.6 毫升过滤溶液。NMR 代谢组学中的样品制备是关键。由于该过程可能会重复数百次，因此应以完全相同的方式准备，以保证观察到的差异不是由于样品制备，而是由于所研究植物之间的真正差异。
纯位移 NMR。NMR 波谱是在 FID 信号的傅里叶变换后获得的。FID 信号可以分解为两个部分，化学位移调制和负责 J 耦合分裂模式的 J 耦合调制。
J 耦合调制可以通过 J 耦合重新聚焦元件重新聚焦，该元件选择性地反转被动自旋，而主动自旋不受影响。在两个相等的延迟之后，化学 J 耦合完全重新聚焦。基于抗 z-COSY 实验的 Psyche 元件是最稳健和最灵敏的宽带重新聚焦元件之一，其特性使其适用于 NMR 代谢组学。
纯位移实验基于在化学位移记录过程中重新聚焦 J 偶联演变。这通常是通过增加延迟以移动 J 耦合重新聚焦点来实现的。由于化学位移的演变频率高于 J 耦合，因此可以干涉图方式记录同核解耦实验。
干涉图采集包括以小块记录 FID，其中 J 耦合演变的重新聚焦点始终与采集块的中心重合。解耦的 FID 是通过连接每个连续的 chunk 来构建的。NMR 数据采集设置，将样品传输到 NMR 波谱仪。
调谐并匹配探头，锁定和垫片样品。校准 90 度硬脉冲。运行标准的 1D 质子 NMR 波谱。
心理实验。从 Bruker TopSpin 文库中选择重置 psyche 1D 脉冲序列。将 spectrum width 设置为 5 kHz。
松弛恢复延迟至少为 1 秒或 2 秒。虚拟对象扫描到 16。扫描次数为 64 或 128 以及每个模块的复杂数据点数量（64 或 128）设置所需的线性调频脉冲翻转角度激励。
在灵敏度和低再耦合伪影之间，最好将常数设置为 61 到 20 度，10 kHz 作为线性调频脉冲带宽。将硬脉冲长度设置为先前校准的音量，将 psyche 形状脉冲长度设置为 30 毫秒。选择 Crp_psyche。
20 个形状的脉冲用于心理元素。根据探针的不同，在 psyche 元件期间施加的脉冲场梯度强度通常设置在梯度最大强度的 1% 到 4% 之间。选择 RECT。
1 表示梯度形状脉冲。设置要获取的块数以重建纯 shift FID。通常，16 或 32 个模块，每个模块有 64 或 128 个复数点，将提供足够的数字分辨率、运行频谱并处理数据。
使用布鲁克的 proc_reset AU 计划，然后是傅里叶变换。我们建议使用零填充和正弦钟切趾来变换光谱。Psyche 是一种伪 2D 干涉图实验。
它是来自每个模块采集过程中小 J 耦合演变的周期性边跨伪影的软件，在纯化合物的分析中，通常范围为 5 到 20 毫秒，这些伪影可以忽略不计，因为它们通常占母峰的 5% 以下。然而，在复杂的混合物中，某些代谢物的边跨伪影可能与浓度较低的代谢物的信号一样大或更大，从而影响代谢分析的准确性。这些伪影可以使用莫里斯实验室 SAPPHIRE 心理实验中开发的称为 SAPPHIRE psyche 的心理实验修改来有效去除。
为了获得解耦的频谱，脉冲序列在每个模块中间的 J 耦合中获取小块 FID 重新聚焦。然而，在每个区块期间都会发生一个小的 J 耦合演变，并产生周期性的边带伪影。SAPPHIRE psyche 实验是对常规 psyche 序列的修改，其中这些周期性伪影通过系统相位调制去除，通过 J 重新聚焦点的偏移来实现。
在添加每个相位调制后，残余 J 耦合演变受到高度抑制，从而产生更清晰的纯移位频谱。选择 SAPPHIRE psyche 脉冲序列并设置脉冲序列参数。该序列不在布鲁克的范围内，但是，序列和处理程序可以从曼彻斯特 NMR 方法组网站获得。
标准参数设置为以下值，5 kHz 的频谱宽度，至少 1 或 2 秒的弛豫延迟。16 次虚拟扫描，每个增量 8 次或 16 次扫描，D2 设置为 14 毫秒。此参数确保弛豫 T2 在每个 J 调制增量中保持不变。
设置所需的线性调频脉冲翻转角度激励值和脉冲带宽。将硬脉冲长度设置为先前校准的值，将心理形状脉冲长度设置为 30 毫秒。选择 psyche 元素的 PSYCHE_Saltire_10kHz_30m 形状脉冲。
设置在 psyche 元素期间应用的脉冲场梯度的强度。选择 RECT. 1 作为渐变形状。
在 F2 中设置 Sapphire J 调制增量的数量，通常为 8 个增量，可确保出色地抑制边带伪影。使用以下表达式设置根据所选 F3 光谱窗口值计算的 F1 和 F2 光谱窗口。描述为 SW1 上的 1 的纯移位块持续时间通常设置在 20 到 40 毫秒之间。
设置纯 shift 块的数量。由于 SAPPHIRE psyche 需要补偿第一个 block 的 de耦phase modulation 需要添加一个额外的 block。通常，17 或 33 个块提供足够的数字分辨率。
处理数据，在 pm_pshift 和 pm_fidadd AU 程序中执行，然后进行傅里叶变换，我们建议使用零填充来变换光谱并分配钟形切趾。结果，SAPPHIRE psyche 实验通过将耦合共振坍缩成漂亮、尖锐的单一体来提高光谱分辨率，如三种不同的植物基质所示。例如，香草叶、秘鲁果实和具有 SAPPHIRE Psyche 复合物多重性的马铃薯块茎，高柠檬酸的高度耦合氢产生几乎连续的信号，在 40 赫兹范围内扩展，坍缩成三个尖锐的单线态。
减少可能掩盖该地区其他信号的拥挤。获得分辨率还有助于清楚地解开 2.6 至 2.8 PPM 之间的高度重叠区域，其中同柠檬酸是内酯，并且出现苹果酸共振。例如，由于分辨率的显著提高，香草中的关键生物标志物与常规质子 NMR 中葡萄糖苷的信号重叠在 SAPPHIRE 波谱中可以更好地识别。结论。
Pure Shift 是植物代谢组学的优秀新工具。它大大提高了谱图分辨率，因此可以更轻松地识别代谢物、进行更精细的相关度量分析以及更好地解释多变量分析。观看此视频后，您将很好地了解如何为 NMR 分析准备不同的计划提取物，以及如何记录最佳的纯位移心理和 SAPPHIRE 心理波谱。
