O objetivo deste procedimento é analisar extratos vegetais por RMN de deslocamento puro. O protocolo a seguir inclui aspectos-chave na preparação da amostra de diferentes matrizes vegetais, folhas de baunilha, tubérculos de batata e frutos de groselha-do-cabo, e o procedimento detalhado de RMN passo a passo para registrar a psique de mudança pura ideal e os espectros de psique SAPPHIRE. O perfil metabólico por RMN de prótons é a arte de analisar sinal por sinal na miríade de sinais dentro dos espectros de RMN de uma mistura biológica complexa com o objetivo de identificar cada metabólito nessa mistura.
O objetivo é descrever biomarcadores que possam estar associados à quimiotaxonomia, fenotipagem, propriedades organolépticas, denominação de origem, respostas metabólicas, entre outras áreas importantes das ciências vegetais. A RMN de prótons é comumente usada no perfil metabólico. No entanto, o grande número de sinais com multiplicidades expandidas confinadas em uma faixa espectral de produto estreita leva a uma sobreposição extensa, complicando a análise e a interpretação do espectro.
Normalmente, uma única ressonância tem uma largura que varia de um a cinco Hertz. No entanto, um sinal altamente acoplado pode se espalhar em mais de 25 a até 50 Hertz, aumentando a probabilidade de sobreposição do sinal. Para superar essa limitação, aplicamos o método moderno de RMN de deslocamento puro para anunciar a resolução espectral como mostrado aqui em três cenários diferentes de plantas.
A preparação da amostra, a preparação do extrato da planta podem ser realizadas de várias maneiras e o procedimento dependerá da matriz. Os frutos da groselha-do-cabo foram homogeneizados em um suco primeiro. As folhas de baunilha foram usadas intactas e as batatas foram cortadas em fatias protegidas da oxidação.
Em todos os casos, o material foi liofilizado, triturado e depois extraído. Para os frutos de groselha-do-cabo e as batatas, foi utilizada água para a extração auxiliada por sonicação. O sobrenadante foi recuperado por centrifugação, qualquer líquido foi seco por liofilização ou speed vac.
O extrato seco foi ressuspenso em tampão oxalato, evaporado até a secura e dissolvido novamente em D2O contendo TMSP. No caso da baunilha, a extração foi direta usando tampão fosfato deuterado contendo TMSP e metanol deuterado. O sobrenadante também foi recuperado por centrifugação.
Todas as amostras foram filtradas através de um filtro de seringa de PTFE, e os tubos de RMN foram preenchidos com 0,6 mililitros da solução filtrada. A preparação da amostra na metabolômica de RMN é fundamental. Como o procedimento será repetido talvez centenas de vezes, ele deve ser preparado exatamente da mesma maneira, a fim de garantir que a variação observada não se deva ao preparo da amostra, mas a diferenças reais entre as plantas estudadas.
RMN de deslocamento puro. O espectro de RMN é obtido após a transformada de Fourier do sinal FID. O sinal FID pode ser decomposto em dois componentes, modulação de deslocamento químico e modulação de acoplamento J responsável pelo padrão de divisão de acoplamento J.
A modulação do acoplamento J pode ser refocada por um elemento de refocalização do acoplamento J, que inverte seletivamente os spins passivos enquanto os spins ativos permanecem inalterados. Após dois atrasos iguais, o acoplamento químico J é totalmente reorientado. O elemento Psyche baseado em um experimento anti-z-COSY é um dos elementos de refocalização de banda larga mais robustos e sensíveis, propriedades que o tornam adequado para metabolômica de RMN.
Experimentos de deslocamento puro são baseados na reorientação da evolução do acoplamento J durante o registro de deslocamento químico. Isso normalmente é feito aumentando os atrasos para mover o ponto de refocagem do acoplamento J. Como a mudança química evolui em uma frequência mais alta do que o acoplamento J, um experimento homonuclear desacoplado pode ser registrado de maneira interferograma.
A aquisição de interferograma, consiste em registrar o FID por pequenos pedaços com o ponto de refocalização da evolução do acoplamento J, sempre coincidindo com o centro do pedaço adquirido. O FID desacoplado é construído concatenando cada parte sucessiva. Configuração de aquisição de dados de RMN, transfira as amostras para o espectrômetro de RMN.
Ajuste e combine a cabeça da sonda, trave e calce a amostra. Calibre o pulso forte de 90 graus. Execute um espectro de RMN de prótons 1D padrão.
Experimento de psique. Selecione a sequência de pulso 1D de psique de redefinição na biblioteca Bruker TopSpin. Defina a largura do espectro para cinco kilohertz.
O atraso de recuperação do relaxamento para pelo menos um ou dois segundos. O manequim faz a varredura para 16. O número de varreduras para 64 ou 128 e o número de pontos de dados complexos por bloco, 64 ou 128, definem a excitação desejada do ângulo de inversão do pulso chirp.
Um bom entre a sensibilidade e os artefatos de baixo reacoplamento é definir a constante de 61 a 20 graus, 10 kilohertz para a largura de banda do pulso chirp. Defina o comprimento do pulso forte para o volume previamente calibrado e o comprimento do pulso da forma psiquética para 30 milissegundos. Escolha o Crp_psyche.
Pulso de 20 formas para o elemento psiquasiado. A intensidade do gradiente do campo de pulso aplicado durante o elemento psique é normalmente definida entre um a 4% da força máxima do gradiente, dependendo da sonda. Escolha RECT.
1 para o pulso de forma gradiente. Defina o número de blocos a serem adquiridos para reconstruir o FID de deslocamento puro. Normalmente, 16 ou 32 blocos com 64 ou 128 pontos complexos por bloco fornecerão resolução digital suficiente, executarão o espectro e processarão os dados.
Com o programa proc_reset AU de Bruker e, em seguida, a transformação de Fourier. Recomendamos transformar o espectro usando preenchimento zero e uma apodização senoidal. Psyche é um experimento de pseudo interferograma 2D.
É um software de artefato de amplitude lateral periódica que chega da evolução do acoplamento J pequeno durante a aquisição de cada bloco que normalmente varia de cinco a 20 milissegundos na análise de compostos puros, esses artefatos podem ser negligenciados, pois normalmente representam menos de 5% do pico pai. No entanto, em misturas complexas, o artefato de amplitude lateral de algum metabólito pode ser tão grande ou maior que o sinal de metabólitos menos concentrados, comprometendo a precisão da análise metabólica. Esses artefatos podem ser removidos com eficiência usando uma modificação do experimento psicológico chamado SAPPHIRE psyche desenvolvido no experimento psiquasia SAPPHIRE do Morris Lab.
Para atingir o espectro desacoplado, a sequência de pulso adquire pequenos pedaços de refoco FID no acoplamento J no meio de cada bloco. No entanto, uma pequena evolução de acoplamento J ocorre durante cada bloco e gera os artefatos periódicos da banda lateral. O experimento da psique SAPPHIRE é uma modificação da sequência regular da psique na qual esses artefatos periódicos são removidos pela modulação sistemática da fase, alcançada pela mudança no ponto de refocalização J.
Depois de adicionar cada modulação de fase, a evolução do acoplamento J residual é altamente suprimida, produzindo um espectro de deslocamento puro muito mais limpo. Selecione a sequência de pulso SAPPHIRE psyche e defina os parâmetros da sequência de pulso. Esta sequência não está no repertório de Bruker, no entanto, a sequência e os programas de processamento podem ser obtidos no site do grupo de metodologia de RMN de Manchester.
Os parâmetros padrão são definidos para os seguintes valores, largura espectral de cinco kilohertz, pelo menos um ou dois segundos de atraso de relaxamento. 16 varreduras fictícias, oito ou 16 varreduras por incremento e D2 definido para 14 milissegundos. Este parâmetro garante que o relaxamento T2 permaneça constante a cada incremento de modulação J.
Defina o valor desejado de excitação do ângulo de inversão do pulso chirp e a largura de banda do pulso. Defina o comprimento do pulso forte para o valor previamente calibrado e o comprimento do pulso da forma psiquística para 30 milissegundos. Escolha o pulso de forma PSYCHE_Saltire_10kHz_30m para o elemento psiquasiado.
Defina a força do gradiente do campo de pulso aplicado durante o elemento psiquasiado. Escolha RECT. 1 para a forma de gradiente.
Defina o número de incrementos de modulação Sapphire J em F2, normalmente oito incrementos garantem uma excelente supressão de artefatos de banda lateral. Defina as janelas espectrais F1 e F2 calculadas a partir do valor da janela espectral F3 selecionada usando as expressões a seguir. A duração do bloco de deslocamento puro descrita como um sobre SW1 é normalmente definida entre 20 a 40 milissegundos.
Defina o número de blocos de deslocamento puros. Como a psique SAPPHIRE precisa compensar a modulação de fase de desacoplamento do primeiro bloco, um bloco extra precisa ser adicionado. Normalmente, 17 ou 33 blocos fornecem resolução digital suficiente.
Processe os dados, execute no pm_pshift e nos programas pm_fidadd AU seguidos pela transformada de Fourier, recomendamos transformar o espectro usando preenchimento zero e atribuir apodização de sino. Resultados, os experimentos de psique SAPPHIRE aumentam a resolução dos espectros colapsando ressonâncias acopladas em belos singlets afiados, como visto demonstrado em três matrizes de plantas diferentes. Folhas de baunilha, frutos de Physalis Peruviana e tubérculos de batata com multiplicidades do complexo SAPPHIRE Psyche, por exemplo, os hidrogênios altamente acoplados de ácido homocítrico que geram sinais quase contínuos que se expandem por 40 Hertz colapsaram em três singletos afiados.
Reduzindo a aglomeração que poderia estar mascarando outros sinais na área. O ganho de resolução também facilitou o desemaranhamento claro da região altamente sobreposta entre 2,6 a 2,8 PPM na qual o ácido homocítrico é lactona e as ressonâncias do ácido málico aparecem. Os principais biomarcadores na baunilha, por exemplo, cujos sinais se sobrepõem aos dos glicosídeos na RMN regular de prótons foram melhor identificados nos espectros SAPPHIRE devido a esse excelente ganho de resolução. Conclusões.
Pure shift é uma excelente nova ferramenta para metabolômica de plantas. Aumentou drasticamente a resolução do espectro e, portanto, permite uma identificação mais fácil de metabólitos, uma análise métrica de correlação mais fina e uma melhor interpretação da análise multivariada. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como preparar diferentes extratos de planos para análise de RMN e como registrar a psique de mudança pura ideal e o espectro psicológico SAPPHIRE.
