מטרת הליך זה היא לנתח תמציות צמחים על ידי תמ"ג טהור. הפרוטוקול הבא כולל היבטים מרכזיים בהכנת הדגימה ממטריצות צמחים שונות, עלי וניל, פקעות תפוחי אדמה ופירות דומדמניות שכמייה, ואת הליך ה- NMR המפורט שלב אחר שלב לתיעוד הנפש הטהורה האופטימלית וספקטרום הנפש ספיר. פרופיל מטבולי על ידי NMR פרוטון הוא אמנות ניתוח אות אחר אות במספר עצום של אותות בתוך ספקטרום NMR של תערובת ביולוגית מורכבת במטרה לזהות כל מטבוליט בתערובת זו.
המטרה היא לתאר סמנים ביולוגיים שיכולים להיות קשורים לכימוטקסונומיה, פנוטיפ, תכונות אורגנולפטיות, מלים של מקור, תגובות מטבוליות בין תחומים חשובים אחרים במדעי הצמח. פרוטון NMR משמש בדרך כלל פרופיל מטבולי. עם זאת, המספר הגדול של אותות עם מכפילי הרחבה המוגבלים בטווח ספקטרלי צר של מוצרים מוביל לחפיפה נרחבת, המסבכת את הניתוח ואת הפרשנות של הספקטרום.
בדרך כלל, לתהודה אחת יש רוחב הנע בין הרץ אחד לחמישה הרץ. עם זאת, אות מצומד מאוד יכול להתפשט מעל 25 עד אפילו 50 הרץ, מה שמגדיל את ההסתברות לחפיפת אות. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מיישמים שיטת NMR מודרנית של שינוי טהור כדי להכריז על הרזולוציה הספקטרלית כפי שמוצג כאן בשלושה תרחישים צמחיים שונים.
הכנת מדגם, הכנת תמצית צמח יכול להתבצע בדרכים רבות ואת ההליך יהיה תלוי מטריצה. פירות דומדמניות הכף עברו הומוגניות למיץ תחילה. עלי הווניל שימשו בשלמותם, ותפוחי האדמה נחתכו מוגנים מפני חמצון.
בכל המקרים, החומר עבר ליופיליזציה, טחינה ולאחר מכן הוצא. עבור פירות דומדמניות הכף ותפוחי האדמה שימשו מים למיצוי בעזרת סוניקציה. הסופרנאטנט הוחזר על ידי צנטריפוגה, כל נוזל יובש על ידי ליופיליזציה או ספיד וואק.
התמצית היבשה הושעתה מחדש במאגר אוקסלט, התאדה ליובש והומסה מחדש ב-D2O המכיל TMSP. במקרה של וניל, המיצוי היה ישיר באמצעות חיץ פוספט deuterated המכיל TMSP ומתנול deuterated. הסופרנאטנט נמצא גם הוא באמצעות צנטריפוגה.
כל הדגימות סוננו דרך מסנן מזרק PTFE, ושפופרות ה-NMR מולאו ב-0.6 מיליליטר של התמיסה המסוננת. הכנת דוגמאות במטבולומיקה NMR היא המפתח. מכיוון שההליך יחזור על עצמו אולי מאות פעמים, יש להכין אותו בדיוק באותו אופן, על מנת להבטיח שהשונות שנצפתה אינה נובעת מהכנת המדגם, אלא מהבדלים אמיתיים בין הצמחים הנחקרים.
תמ"ג משמרת טהורה. ספקטרום ה-NMR מתקבל לאחר התמרת פורייה של אות ה-FID. ניתן לפרק את אות ה-FID בשני רכיבים, אפנון הזזה כימית, ומודולציית צימוד J האחראית על תבנית פיצול הצימוד J.
אפנון צימוד J יכול להיות ממוקד מחדש על ידי אלמנט מיקוד מחדש של צימוד J, אשר הופך באופן סלקטיבי ספינים פסיביים בעוד הספינים הפעילים נשארים ללא השפעה. לאחר שני עיכובים שווים, הצימוד הכימי J ממוקד מחדש במלואו. אלמנט פסיכה המבוסס על ניסוי anti-z-COSY הוא אחד מרכיבי המיקוד מחדש החזקים והרגישים ביותר בפס רחב, תכונות שהופכות אותו מתאים למטבולומיקה של NMR.
ניסויי הזזה טהורה מבוססים על מיקוד מחדש של אבולוציית צימוד J במהלך רישום משמרות כימיות. זה מושג בדרך כלל על ידי הגדלת העיכובים על מנת להזיז את נקודת המיקוד מחדש של צימוד J. כאשר השינוי הכימי מתפתח בתדירות גבוהה יותר מאשר צימוד J, ניתן להקליט ניסוי הומו-גרעיני מנותק באופן אינטרפרוגרמה.
רכישת אינטרפרוגרמה, מורכבת מרישום ה- FID על ידי גושים קטנים עם נקודת המיקוד מחדש של אבולוציית צימוד J, תמיד בקנה אחד עם מרכז הגוש הנרכש. ה-FID המנותק נבנה על ידי שרשור כל קטע עוקב. מערך איסוף נתוני NMR, העבר את הדגימות לספקטרומטר NMR.
כוונן והתאם את ראש הבדיקה, נעל ושיים את הדגימה. כיילו את הדופק הקשיח ב-90 מעלות. הפעל ספקטרום NMR סטנדרטי של פרוטון 1D.
ניסוי פסיכי. בחר את רצף הדופק הנפשי 1D מאופס מספריית Bruker TopSpin. הגדר את רוחב הספקטרום לחמישה קילוהרץ.
ההתאוששות הרפיה לעכב לפחות שנייה או שתיים. הדמה סורקת ל-16. מספר הסריקות ל-64 או 128 ומספר נקודות הנתונים המורכבות לכל בלוק, 64 או 128, מגדירים את עירור זווית הדופק הרצוי.
טוב בין רגישות לשחזור נמוך הוא להגדיר את הקבוע 61 עד 20 מעלות, 10 קילוהרץ עבור רוחב הפס של פולס הציוץ. הגדר את אורך הדופק הקשיח לעוצמת הקול שכויל בעבר ואת אורך הדופק בצורת הנפש ל- 30 אלפיות השנייה. בחר את Crp_psyche.
20 דופק צורה לאלמנט הנפש. חוזק שיפוע שדה הדופק המופעל במהלך אלמנט הנפש מוגדר בדרך כלל בין אחד ל -4% מהחוזק המרבי של השיפוע בהתאם לבדיקה. בחר RECT.
1 עבור פולס הצורה ההדרגתית. הגדר את מספר הבלוקים שיש לרכוש כדי לבנות מחדש את ההזזה הטהורה FID. בדרך כלל 16 או 32 בלוקים עם 64 או 128 נקודות מורכבות לכל בלוק יספקו מספיק רזולוציה דיגיטלית, ירוצו את הספקטרום ויעבדו את הנתונים.
עם תוכנית proc_reset AU של Bruker, ולאחר מכן התמרת פורייה. אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ואפודיזציית פעמון סינוס. Psyche הוא ניסוי אינטרפרוגרמה דו-ממדית מדומה.
זוהי תוכנה מחפץ תוחלת צד מחזורית המגיעה מאבולוציית צימוד J הקטנה במהלך הרכישה של כל בלוק שבדרך כלל נעה בין חמש ל -20 אלפיות שנייה בניתוח של תרכובת טהורה ניתן להזניח ממצאים אלה מכיוון שהם בדרך כלל מייצגים פחות מ -5% משיא האב. עם זאת, בתערובות מורכבות, מוטת הצד של מטבוליט כלשהו יכולה להיות גדולה או גדולה יותר מהאות של מטבוליטים פחות מרוכזים ובכך לפגוע בדיוק הניתוח המטבולי. ניתן להסיר ממצאים אלה ביעילות באמצעות ניסוי שינוי הנפש שנקרא SAPPHIRE psyche שפותח בניסוי הנפש SAPPHIRE של מעבדת מוריס.
כדי להשיג את הספקטרום המנותק, רצף הפולסים רוכש נתחים קטנים של מיקוד מחדש של FID בצימוד J באמצע כל בלוק. עם זאת, אבולוציה קטנה של צימוד J מתרחשת במהלך כל בלוק ויוצרת את חפצי רצועת הצד המחזורית. ניסוי הנפש ספיר הוא שינוי של רצף הנפש הרגיל שבו חפצים מחזוריים אלה מוסרים על ידי אפנון פאזה שיטתי, המושג על ידי שינוי בנקודת המיקוד מחדש של J.
לאחר הוספת כל אפנון פאזה, אבולוציית צימוד J השיורית מדוכאת מאוד, ומניבה ספקטרום הזזה טהור ונקי הרבה יותר. בחר את רצף הדופק הנפשי SAPPHIRE והגדר את פרמטרי רצף הדופק. רצף זה אינו נמצא ברפרטואר של ברוקר, אולם ניתן לקבל את הרצף ואת תוכניות העיבוד מאתר האינטרנט של קבוצת מתודולוגיית NMR של מנצ'סטר.
הפרמטרים הסטנדרטיים מוגדרים לערכים הבאים, רוחב ספקטרלי של חמישה קילוהרץ, לפחות שנייה או שתיים של עיכוב הרפיה. 16 סריקות דמה, שמונה או 16 סריקות בכל הפרש קבוע, ו-D2 מוגדר ל-14 אלפיות השנייה. פרמטר זה מבטיח שההרפיה T2 תישאר קבועה עם כל תוספת אפנון J.
הגדר את ערך העירור הרצוי של דופק הדופק הרצוי ואת רוחב הפס של הדופק. הגדר את אורך הדופק הקשיח לערך שכויל קודם לכן ואת אורך הפולס בצורת הנפש ל- 30 אלפיות השנייה. בחר את דופק צורת PSYCHE_Saltire_10kHz_30m עבור אלמנט הנפש.
הגדר את חוזק שיפוע שדה הדופק שהוחל במהלך אלמנט הנפש. בחר RECT. 1 לצורת מעבר הצבע.
הגדר את מספר הפרשי אפנון Sapphire J ב- F2, בדרך כלל שמונה הפרשים מבטיחים דיכוי מצוין של תוצרי פס צד. הגדר את החלונות הספקטרליים F1 ו- F2 שחושבו מערך החלון הספקטרלי F3 שנבחר באמצעות הביטויים הבאים. משך בלוק ההזזה הטהור המתואר כבלוק מעל SW1 מוגדר בדרך כלל בין 20 ל- 40 אלפיות השנייה.
הגדר את מספר גושי ההזזה הטהורים. מכיוון שהנפש של ספיר צריכה לפצות על אפנון שלב הניתוק של הבלוק הראשון, יש להוסיף בלוק נוסף. בדרך כלל, 17 או 33 בלוקים נותנים מספיק רזולוציה דיגיטלית.
לעבד את הנתונים, לבצע pm_pshift ואת תוכניות AU pm_fidadd ואחריו התמרת פורייה, אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ולהקצות apodization פעמון. תוצאות, ניסויי הנפש של SAPPHIRE מגבירים את רזולוציית הספקטרום על ידי קריסת תהודה מצומדת לסינגלים חדים ונחמדים כפי שניתן לראות בשלוש מטריצות צמחיות שונות. עלי וניל, פירות Physalis Peruviana ופקעות תפוחי אדמה עם הכפלות מורכבות של SAPPHIRE Psyche לדוגמה, המימן המצומד מאוד של חומצה הומוציטרית המייצרים אותות כמעט רציפים המתרחבים דרך 40 הרץ קרסו לשלושה סינגלים חדים.
צמצום הצפיפות שעלולה להסוות איתותים אחרים באזור. הרזולוציה המצטברת גם הקלה על התרת האזור החופף מאוד בין 2.6 ל -2.8 PPM שבו חומצה הומוציטרית היא לקטון ותהודה חומצה מאלית מופיעים. סמנים ביולוגיים מרכזיים בוניל, למשל, שמאותתים על חפיפה עם אלה של גלוקוזידים ב-NMR רגיל של פרוטון, זוהו טוב יותר בספקטרום SAPPHIRE הודות לעלייה יוצאת דופן זו ברזולוציה. מסקנות.
Pure Shift הוא כלי חדש ומצוין למטבוליקה של צמחים. זה הגדיל באופן דרסטי את רזולוציית הספקטרום ולכן מאפשר זיהוי מטבוליטים קל יותר, ניתוח מטרי מתאם עדין יותר, ופרשנות טובה יותר של ניתוח רב משתני. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד להכין תמצית תוכנית שונה לניתוח NMR וכיצד להקליט נפש משמרת טהורה אופטימלית וספקטרום נפשי ספיר.
