巨噬细胞增多症是一种内吞途径，对包括癌症代谢在内的各种细胞过程很重要。该协议允许您量化体外细胞中巨噬细胞增多的程度。自动化旨在最大限度地提高可重复性，生产率并减少实验差异。
此外，荧光显微镜允许您目视检查样品以确定实验质量并评估其他巨噬细胞体特征。与我一起演示该过程的将是来自我实验室的研究助理Cheska Marie Galapate。对于带盖玻片格式的24孔板，使用镊子从乙醇浴中夹住单个盖玻片。
将盖玻片轻拍到板的内壁以除去多余的乙醇，并将盖玻片平放在孔的底部。乙醇蒸发后，用DPBS洗涤盖玻片两次，然后通过向每个孔中加入500微升细胞悬浮液，将细胞接种在盖玻片顶部。将细胞置于具有5%二氧化碳的37摄氏度细胞培养箱中，直到细胞汇合度在大促卵体标记前一天达到60%至80%。
在标记大促卵泡体的前一天，用500微升预热的无血清培养基替换孔中的培养基，并将细胞置于培养箱中16至24小时。对于96孔微孔板形式，首先将细胞悬浮液转移到25毫升试剂储液器中。然后使用多通道移液管，将100微升的细胞悬浮液接种到具有光学透明环烯烃或玻璃底部的黑色96孔高内涵筛选微孔板中。
孵育细胞，直到细胞汇合度在巨噬细胞体标记前一天达到60%至80%。在标记大促卵体的前一天，使用多通道吸液适配器从每个孔中取出并丢弃培养基，用于连接到真空泵的标准吸头。或者，可以使用多通道移液器。
使用试剂储液器和多通道移液器，轻轻地向每个孔中加入100微升预热的无血清培养基，然后将细胞置于细胞培养箱中16至24小时。对于具有盖玻片形式的24孔板，用200微升无血清培养基用荧光团标记的高分子量葡聚糖替换孔中的培养基，并将细胞置于细胞培养箱中30分钟。孵育后，吸出培养基，并使用预冷的洗涤瓶用冰冷的PBS轻轻但快速地洗涤细胞五次。
在洗涤过程中用手用力摇动盘子，以帮助去除粘在盖玻片上的葡聚糖聚集体。接下来，通过加入350微升3.7%甲醛并孵育20分钟来固定细胞，然后吸出固定溶液并用PBS洗涤细胞两次。在PBS中用350微升DAPI染色细胞核。
20分钟后，吸出DAPI溶液并用PBS洗涤细胞三次。将有机硅隔离器并排放在显微镜载玻片上，以获得成像自动化所需的盖玻片的均匀间距和可重复的定位。然后，对于每个盖玻片，在隔离器的开放空间内的显微镜载玻片上添加一滴硬化荧光安装介质。
使用镊子拿起盖玻片，通过在无绒擦拭物上轻轻敲击盖玻片的侧面来去除多余的PBS。接下来，将盖玻片倒置在安装介质的落下，然后使用封闭的镊子轻轻敲击盖玻片，以清除安装介质上的气泡。将载玻片存放在黑暗的环境中，让安装介质在室温下干燥，通常需要16到24小时。
在成像之前，从显微镜载玻片上取下隔离器。将载玻片平衡到室温后，使用用无氨玻璃清洁剂润湿的棉质贴片清洁盖玻片。随后，使用用70%乙醇润湿的清洁棉质涂抹器清洁盖玻片并保持干燥。
对于96孔微孔板形式，在如前所述吸入孔后，将40微升含有荧光团标记的高分子量葡聚糖的无血清培养基加入孔中，然后将细胞在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育后，通过手动将板倒置到空的五升烧杯中，将培养基丢弃在微孔板中，然后通过以轻微的角度将板垂直缓慢浸入充满冰冷PBS的两升烧杯中来冲洗细胞和微孔板两次，然后通过将板倒置到五升烧杯中来丢弃微孔板中的PBS。在最后一次PBS冲洗后，使用25毫升试剂储液器和多通道移液器向每个孔中加入PBS中100微升3.7%甲醛来固定细胞。
在室温下孵育20分钟后，取出固定溶液并使用浸没和轻拂技术用PBS洗涤细胞。第二次PBS洗涤后，用每孔PBS中的100微升DAPI染色细胞核。20分钟后，如前所述，用冰冷的PBS冲洗细胞三次。
通过将微孔板倒置在不起毛的湿巾上，去除任何残留的PBS。然后使用25毫升试剂储液器和多通道移液器向每个孔中加入100微升新鲜PBS。在成像之前，让板平衡到室温，然后用不起毛的擦拭擦干细胞培养板。
或者，将盖在四摄氏度的光照下将盘子存放长达一周。对于自动大卵泡体成像，创建一个自动化协议，以在葡聚糖荧光团和DAPI的波长通道中采集具有40X空气物镜的图像。接下来，使用预测具有最高水平巨肺细胞增多症的样本优化曝光设置，以避免过度暴露，这可能导致信号饱和和强度数据丢失。
使用可轻松、一致地定位样品的对焦设置，以生成高质量的图像。在每个孔或盖玻片上采集多张图像，以考虑样品的变异性并获得样品的准确表示。为了确定大棘球指数，通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）减去DAPI的背景和相应的葡聚糖图像。
调整设置，使背景噪声最小化，对DAPI和葡聚糖信号的影响最小甚至没有减法。接下来，利用具有高葡聚糖信号的场，确定强度信号设置，通常称为阈值函数，选择细胞核，然后确定最小强度信号设置，只需要选择大倍体。对于葡聚糖图像，计算所创建的巨噬细胞体选择内的总荧光，或使用选择来确定葡聚糖阳性的总面积。
对于 DAPI 图像，使用选择来确定图像中的细胞核数，以反映存在的细胞数。然后通过将总葡聚糖荧光或面积除以DAPI确定的细胞数量来确定大脊髓细胞指数。在AsPC-1 PDAK细胞中，在加入葡聚糖之前，以每毫升100纳克的速度添加EGF五分钟，激活巨噬细胞增多症。
此外，自分泌EGF激活巨噬细胞增多症可以通过谷氨酰胺剥夺16至24小时来诱导。MIA PaCa-2细胞显示构成性巨噬细胞增多症，其通过75微摩尔EIPA治疗30分钟或用10微摩尔EHop-016治疗两小时来抑制。在剂量反应实验中，在EHop-016和EIPA的较高药物浓度下，大棘球细胞指数逐渐降低，从而证实了构成性Rac1依赖性巨噬细胞增多症的存在。
您可以调整此程序来评估其他荧光标记货物（如白蛋白）的巨噬细胞增多症。此外，建议通过进行细胞活力测定来评估白蛋白的大脊髓细胞摄取是否有助于细胞健康。该技术一直是鉴定癌症和基质细胞中大脊髓细胞营养供应的核心，自动化大大提高了我们的状态测试能力。
