A macropinocitose é um caminho endocítico que é importante para uma variedade de processos celulares, incluindo o metabolismo do câncer. Este protocolo permite quantificar a extensão da macropinocitose em células in vitro. A automação visa maximizar a reprodutibilidade, a produtividade e reduzir a variação experimental.
Além disso, a microscopia fluorescente permite inspecionar visualmente a amostra para determinar a qualidade experimental e avaliar características macropinosas adicionais. Demonstrando o procedimento comigo estará Cheska Marie Galapate, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Para a placa de 24 poços com formato de deslizamento de cobertura, use fórceps para segurar uma única tampa do banho de etanol.
Bata na tampa na parede interna da placa para remover o excesso de etanol e coloque o deslizamento de tampas na parte inferior do poço. Depois que o etanol evaporar, lave a tampa duas vezes com DPBS e, em seguida, semee as células em cima da tampa, adicionando 500 microliters da suspensão celular a cada poço. Coloque as células em uma incubadora celular Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono até que a confluência celular atinja de 60 a 80% no dia anterior à rotulagem macropinosome.
Um dia antes da rotulagem macropinosa, substitua a mídia nos poços por 500 microliters de mídia pré-aquecida sem soro e coloque as células na incubadora por 16 a 24 horas. Para o formato de microplacão de 96 poços, comece transferindo a suspensão celular para um reservatório de reagente de 25 mililitros. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, semente 100 microliters da suspensão celular para cada poço de uma microplaca de triagem de 96-bem-falantes com um olefina cíclico opticamente claro ou fundo de vidro.
Incubar as células até que a confluência celular atinja de 60 a 80% no dia anterior à rotulagem macropinosa. Um dia antes da rotulagem macropinosa, remova e descarte a mídia de cada poço usando um adaptador de aspiração multicanal para pontas padrão anexadas a uma bomba de vácuo. Alternativamente, uma pipeta multicanal pode ser usada.
Usando um reservatório de reagente e pipeta multicanal, adicione suavemente 100 microliters de mídia pré-aquecida sem soro a cada poço e, em seguida, coloque as células na incubadora celular por 16 a 24 horas. Para a placa de 24 poços com formato de deslizamento de cobertura, substitua a mídia nos poços por 200 microliters de mídia livre de soro com dextran de alto peso molecular com rótulo fluorforeiros e coloque as células na incubadora celular por 30 minutos. Após a incubação, aspire a mídia e lave suavemente as células cinco vezes com PBS gelado usando uma garrafa de lavagem pré-resfriada.
Agite firmemente a placa à mão durante as lavagens para ajudar na desalojação dos agregados do Dextran que ficam presos às tampas. Em seguida, fixar as células adicionando 350 microlitadores de 3,7% de formaldeído e incubando por 20 minutos, em seguida, aspire a solução de fixação e lave as células com PBS duas vezes. Manche os núcleos com 350 microlitres de DAPI em PBS.
Após 20 minutos, aspire a solução DAPI e lave as células com PBS três vezes. Adere aos isoladores de silicone lado a lado em um slide de microscópio para obter mesmo espaçamento e localização reprodutível das tampas necessárias para automação de imagens. Em seguida, para cada deslizamento de cobertura, adicione uma gota de mídia de montagem de fluorescência de endurecimento no slide do microscópio dentro do espaço aberto do isolador.
Pegue uma mancha de cobertura usando fórceps e remova o excesso de PBS tocando suavemente o lado das tampas em uma limpeza sem fiapos. Em seguida, coloque o deslizamento de cobertura de cabeça para baixo na queda da mídia de montagem e toque suavemente no deslizamento de cobertura usando fórceps fechados para remover bolhas da mídia de montagem. Armazene os slides em um ambiente escuro e permita que a mídia de montagem seque à temperatura ambiente, normalmente levando de 16 a 24 horas.
Antes de fotografar, remova os isoladores do slide do microscópio. Depois que os slides tiverem sido equilibrados à temperatura ambiente, limpe as tampas usando um aplicador de ponta de algodão molhado com limpador de vidro sem amônia. Posteriormente, use um aplicador de ponta de algodão limpo molhado com 70% de etanol para limpar o deslizamento de tampas e deixá-lo seco.
Para o formato de microplaca de 96 poços, depois de aspirar os poços como demonstrado anteriormente, adicione 40 microliters de mídia livre de soro com dextran de alto peso molecular rotulado para os poços, em seguida, incubar as células na incubadora celular por 30 minutos. Após a incubação, descarte a mídia na microplaca, movendo manualmente a placa de cabeça para baixo em um béquer vazio de cinco litros, depois enxágue as células e a microplaca duas vezes submergindo lentamente a placa verticalmente em um leve ângulo em um béquer de dois litros cheio de PBS frio e, posteriormente, descartando o PBS na microplaca, movendo a placa de cabeça para baixo no béquer de cinco litros. Após a última lavagem do PBS, fixe as células adicionando 100 microlitrais de 3,7% de formaldeído em PBS a cada poço usando um reservatório de reagente de 25 mililitros e uma pipeta multicanal.
Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente, remova a solução de fixação e lave as células com PBS usando a técnica de submersão e movimento. Após a segunda lavagem pbs, colorindo os núcleos com 100 microliters de DAPI em PBS por poço. Após 20 minutos, enxágue as células três vezes com PBS gelado, como demonstrado anteriormente.
Remova qualquer PBS residual tocando a microplacão de cabeça para baixo em uma limpeza sem fiapos. Em seguida, adicione 100 microliters de PBS frescos a cada poço usando um reservatório de reagente de 25 mililitros e pipeta multicanal. Antes da imagem, deixe a placa equilibrar à temperatura ambiente, em seguida, limpe a placa de cultura celular seca com um lenço sem fiapos.
Alternativamente, armazene a placa coberta de luz a quatro graus Celsius por até uma semana. Para imagens macropinosas automatizadas, crie um protocolo de automação para adquirir as imagens com um objetivo de ar 40X no canal de comprimento de onda do dextran fluorophore e DAPI. Em seguida, otimize as configurações de exposição usando uma amostra prevista para ter o mais alto nível de macropinotose para evitar a exposição excessiva, o que pode resultar em saturação do sinal e perda de dados de intensidade.
Use configurações de foco que localizem a amostra de forma facilmente e consistente para produzir imagens de alta qualidade. Adquira várias imagens em cada poço ou se encobre para explicar a variabilidade da amostra e obter uma representação precisa da amostra. Para determinar o índice macropinocítico, subtraia o fundo para o DAPI e a imagem correspondente do dextran aplicando a função apropriada, frequentemente chamada de função bola rolando.
Ajuste as configurações para que o ruído de fundo seja minimizado com efeito mínimo a sem subtração no sinal DAPI e dextran. Em seguida, usando um campo com sinal de dextran alto, determine as configurações de sinal de intensidade, frequentemente chamadas de função limiar, para selecionar os núcleos e, em seguida, determinar a configuração de sinal de intensidade mínima necessária para selecionar apenas os macropinossomos. Para a imagem do Dextran, calcule a fluorescência total dentro da seleção macropinosa criada ou utilize a seleção para determinar a área total positiva para o dextran.
Para a imagem DAPI, use a seleção para determinar o número de núcleos na imagem para refletir o número de células presentes. Em seguida, determine o índice macropinolítico dividindo a fluorescência ou área total do dextran pelo número de células determinadas pelo DAPI. Nas células AsPC-1 PDAK, adicionar EGF a 100 nanogramas por mililitro por cinco minutos antes de adicionar o dextran ativa a macropinocise.
Além disso, a ativação autocrina EGF da macropinocitose pode ser induzida pela privação de glutamina por 16 a 24 horas. As células MIA PaCa-2 apresentam macropinocise constitutiva que é inibida por um tratamento de 30 minutos com 75 IEPA micromolar ou um tratamento de duas horas com 10 micromolar EHop-016. Em um experimento de resposta a doses, o índice macropinóctico diminuiu gradualmente em concentrações mais altas de medicamentos de EHop-016 e EIPA, confirmando assim a existência de macropinocise dependente de Rac1 constitutiva.
Você pode adaptar este procedimento para avaliar a macropinocise de outras cargas fluorescentes marcadas, como albumina. Além disso, recomenda-se avaliar se a absorção macropinóctica da albumina contribui para o condicionamento celular realizando ensaios de viabilidade celular. Essa técnica tem sido central para a identificação do fornecimento de nutrientes macropinocíticos em células cancerosas e estromais e a automação aumentou muito nossa capacidade de teste de condição.
