荧光活化细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）以确定放射性信号的细胞来源

该方案是对体内成像的补充。它允许放射性示踪剂的细胞类型和细胞水平定量，这与在体内获得的量表不同。该技术的主要优点是其灵敏度和通过使用放射性配体和细胞分选给出的细胞分辨率。

打开照相机并加载操作软件。单击"主 XYZ"阶段按钮以执行归位。设置由一个 10 分钟的扫描采集组成的实验。

将"步进"模式设置为"精细"，将"采集"模式设置为"列表"模式以记录整个发射光谱。设置床，确保加温系统，呼吸传感器和麻醉功能正常且安全。然后，在动物头部的位置放置一个幻影。

通过在屏幕底部的三个图像的帮助下滑动三个维度的光标来设置扫描区域。确保幻像和动物的扫描体积相同。启动幻像扫描，以便使用先前建立的参数进行后续校准。

确保在适当的环境中工作，授权用于涉及放射性的实验。将100微克三丁基素前体与碘化钠和5微升37%对乙酰乙酸在70摄氏度下在手套箱中的热循环器中孵育20分钟。使用50%乙腈在水中稀释反应，以达到500微升的体积。

将500微升稀释的反应注入反相柱上。用线性梯度HPLC分离CLINDE，在7毫摩尔磷酸中运行从5%至95%ACN运行10分钟。将分离物在水中稀释以达到10毫升的最终体积，然后将稀释的反应注入浓缩柱上。

用300微升无水乙醇从柱中洗脱CLINDE，然后通过在室温下在真空离心机中孵育乙醇40分钟来蒸发乙醇。将含有CLINDE的残留物稀释在300微升盐水中，以形成储备溶液。测量其放射性后，将储备溶液在盐水中稀释，以获得500微升中0.037兆贝克勒尔的溶液。

建立冷参比化合物的标定曲线，并解析线性回归方程:Y等于AX加B，得到A和B系数。X表示冷化合物的质量，Y表示曲线下的面积。检查放射性配体曲线下的面积，根据校准曲线和放射性配体曲线下的面积测量450纳米处的紫外吸光度。

估计质量并测量放射性配体的活性。确保比活性大于每微摩尔1， 000千兆贝克勒。单击"更新图像"按钮以更新动物位置。

通过借助屏幕底部的三个图像滑动光标来设置扫描区域。在 60 分钟扫描（共 60 帧一分钟）上设置实验。重用最初设置的所有其他参数。

注入500微升放射性示踪剂，然后用300微升无菌0.9%氯化钠冲洗管子。同时，单击"开始采集"以开始扫描。打开扫描重建软件，然后打开数据集，查找在扫描文件夹中创建的文件名参数文件。

选择感兴趣的同位素。请注意，列表模式参数允许在此步骤中选择多个同位素。设置不同的重建参数，如体素大小、子集数和迭代，如手稿中所述。

选择输出格式为NIFTI，然后选择开始SPECT重建。使用扁平的金属刮刀和剃须刀片来剖析大脑感兴趣的区域。将组织置于两毫升离心管中并称量获得的组织。

将样品放入装有一毫升无钙和无镁HBSS的两毫升离心管中，然后在室温下以300倍G离心两分钟，并在不干扰沉淀的情况下除去上清液。加入1， 900微升酶混合物，并在37摄氏度下孵育15分钟，同时每五分钟倒置搅拌一次管。加入30微升酶混合物两个。

用1， 000微升移液器来回轻轻搅拌30次。然后，将混合物在37摄氏度下孵育15分钟，同时每五分钟倒置搅拌一次管。用200微升移液管和10微升移液器轻轻来回混合，然后将混合物在37摄氏度下孵育10分钟以解离组织。

用70微米的细胞过滤器过滤细胞，并加入10毫升无钙和无镁的HBSS。在室温下以300倍G离心10分钟，并在不干扰沉淀的情况下除去上清液。对于髓鞘耗竭，用400微升髓鞘去除缓冲液重悬沉淀，然后加入100微升髓鞘去除珠，然后在4摄氏度下孵育15分钟。

加入5毫升髓鞘去除缓冲液，室温下离心300倍G，持续10分钟。加入500微升髓鞘去除缓冲液，并将悬浮的沉淀放入磁场柱中。用一毫升髓鞘去除缓冲液洗涤柱四次。

在室温下以300倍G离心两分钟，并在不干扰沉淀的情况下除去上清液。短暂涡旋以解离细胞并加入五微升的Fc Block CD32。加入100微升感兴趣的一抗混合物，并在4摄氏度下孵育20分钟。

在4摄氏度下以350倍G离心5分钟，并在不干扰沉淀的情况下除去上清液。将试管倒置在软纸上。短暂涡旋试管，然后加入100微升二抗混合物，并在4摄氏度下孵育15分钟。

加入一毫升髓鞘去除缓冲液，重复离心。丢弃上清液，在软纸上倒置印管。将细胞重悬于250微升无菌PBS中，并直接进行细胞分选。

野生型大鼠的体内SPECT扫描显示，脂多糖注射部位的CLINDE结合高于大脑的对侧区域。接受荧光活化细胞分选放射性配体处理组织或FACS-RTT的离体样品显示仅在小胶质细胞中存在较多的CLINDE结合位点，表明大脑同侧CLINDE信号的细胞起源是小胶质细胞。TgF344-AD大鼠12个月时易位蛋白或TSPO结合的增加仅限于星形胶质细胞。

在24个月大的大鼠中，由于星形细胞和小胶质细胞的改变，观察到TSPO结合的增加。在较老的TgF344-AD大鼠中，纹状体星形胶质细胞与野生型相比显示出降低的5HT2AR密度。当对人AD死后样本进行FACS-RTT时，与年龄匹配的对照相比，在AD受试者的星形胶质细胞和小胶质细胞中均观察到TSPO的皮质过表达。

使用放射性时，请遵循无线电防护说明，并穿戴适当的个人防护设备。然后，在手术后，确保对工作环境进行净化。在此程序之后，可以在分离的细胞群上轻松进行蛋白质定量和基因表达分析。