时间分辨Förster共振能量转移测定法，用于测量人细胞中的内源性磷酸化STAT蛋白

基于TR-FRET的测定为JAK / STAT信号通路的特定和选择性调节剂的筛选和药理学表征提供了新的经济高效的工具。这种技术比蛋白质印迹和ELISA等传统方法更容易，快速，可重复和稳健。无需洗涤步骤，只需一步即可添加试剂。

只要有特异性抗体可用，该免疫测定平台就可以很容易地应用于其他细胞信号蛋白。为了设计可重复的检测方法，您必须使用良好的细胞培养实践并建立标准操作程序。此外，您必须仔细优化细胞培养和处理条件。

演示该程序的将是我们实验室的科学家Genevieve Chatel。首先，使用补充有10%FBS的DMEM在加湿的37摄氏度和5%二氧化碳培养箱中培养HeLa和A431细胞。当细胞达到70%至80%汇合度时，胰蛋白酶消化它们并传代或用于测定。

为了进行测定，将50微升细胞以预先优化的密度分配到适当培养基中的96孔组织培养处理板中，然后在37摄氏度和5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。第二天，通过将化合物在无血清培养基中连续稀释到聚丙烯96孔板的12孔中，制备测试化合物的中间体两倍和四倍稀释系列。对于细胞刺激，以2X浓度加入含有模拟器的50微升无血清培养基，并在室温或37度下孵育细胞预优化时间。

对于细胞抑制，以4X浓度加入25微升含有抑制剂的无血清培养基，并在室温或37度下孵育细胞预优化时间，然后以4X浓度加入25微升含有刺激剂的无血清培养基，并在预优化时间孵育。接下来，要裂解细胞，制备1X补充的裂解缓冲液并向其中加入磷酸酶抑制剂混合物。小心地除去并丢弃细胞培养基后，立即加入50微升制备的1X补充裂解缓冲液，并在室温下振荡并适度搅拌孵育30分钟。

对于TR-FRET检测，在1X检测缓冲液中制备4X抗体检测混合物，然后在1X检测缓冲液中制备EUAB1和FRAB2抗体溶液，以及EUAB3和FRAB4抗体溶液。最后，将预稀释的EUAB1与预稀释的FRAB2混合以检测磷酸蛋白，将预稀释的EUAB3和预稀释的FRAB4混合以检测总蛋白。然后小心地将15微升的细胞裂解物从96孔培养板移液到白色低容量384孔微孔板的孔中。

接下来，加入15微升阳性对照裂解物和15微升1X裂解缓冲液作为阴性对照以分离测定孔。向含有15微升裂解物的孔中，加入5微升相应的4X抗体检测混合物以检测磷酸蛋白或总蛋白。用板封口剂覆盖板后，根据测定试剂盒在室温下孵育一小时至过夜。

孵育完成后，取出粘合板密封剂，并在TR-FRET兼容的酶标仪上读取板。使用浓度响应曲线表示用于检测和定量U266B1细胞中总STAT1和磷酸-STAT4以及A431细胞中总STAT5的磷酸-STAT5的TR-FRET测定结果。同样，使用浓度响应曲线表示HeLa细胞中用于检测和定量磷酸-STAT3和总STAT3以及磷酸-STAT6和总STAT6的TR-FRET测定。

总体而言，所有检测均显示出鲁棒的TR-FRET信号，宽动态范围，低孔间系数变化以及可接受的信背景比。用JAK激活剂，干扰素α-2B和IL-4和EGF处理细胞显示，在特定酪氨酸残基处STAT磷酸化的预期浓度依赖性增加，而相应的总STAT蛋白保持稳定。JAK抑制剂和厄洛替尼均以浓度依赖性方式抑制相应的磷酸-STAT水平。

使用单板方案通过干扰素α-2B在悬浮细胞系中刺激磷酸-STAT4或通过IL-4在贴壁细胞系中刺激磷酸-STAT6的结果与使用双板方案获得的结果一致，从而显示出两板转移方案对单板多合一孔方案的成功适应性。使用悬浮细胞系的磷酸化-STAT1测定和使用贴壁细胞系的磷酸-STAT3测定的板内变异性研究结果表明，这些磷酸化-STAT测定对于HTS应用具有鲁棒性。必须用磷酸酶抑制剂混合物补充裂解缓冲液，以防止全细胞提取物中存在的活性磷酸化蛋白的磷酸化蛋白的去磷酸化。