该协议提供了一个简单的程序，使通过敏化排放的FRET实验更具可重复性和可比性。FRET的主要优点是实时测量，因此可以解决动态过程。对于使用透射光电倍增管进行激光调整，将含有转染原生质体的八孔载玻片放在显微镜下。
选择空孔后，选择线扫描模式和直方图视图，将激光强度降至最低，并将检测器增益调整为可检测的背景噪声。接下来，在记录相应信号的同时，以0.5%的步长增加激光强度。要使用反射模式进行激光调整，请选择一个空孔，然后应用反射滤光片。
打开反射模式，确保探测器波长范围覆盖激光器的波长。选择线扫描模式和直方图视图，将激光强度降至最低，并将探测器增益调整为可检测的背景噪声。接下来，将物镜移动到最低位置，然后将其向上移动，直到盖玻片的反射可见，然后在记录相应信号的同时以0.5%的步长增加激光强度。
对于数据评估，请按信号强度对数据进行制表和排序，然后将信号强度与相对激光功率绘制，并选择产生相似信号强度的激光强度。为了调整光电倍增管，选择一个空孔并应用反射滤光片，切换到反射模式，并确保探测器波长范围覆盖激光器的波长。选择线阵扫描模式和直方图视图，将探测器增益降低到最大值的一半，并将激光强度调整到可检测的背景噪声。
接下来，将物镜移动到最低位置，然后将其向上移动，直到盖玻片的反射可见，然后以50至100伏步长增加检测器增益并记录相应的信号。对于数据评估，将强度与每个探测器的探测器增益绘制，然后选择单个探测器增益以获得相似的灵敏度。对于图像采集，选择合适的滤光片或二向色镜，并对所有通道使用相同的二向色镜，以实现逐行扫描，然后选择用于活细胞成像的水浸物镜，并选择12位或16位扫描，扫描速度适中。
接下来，定义检测范围，优选470至510纳米用于供体检测，530至600纳米用于受体检测，在FRET对增强青色荧光蛋白或ECFP和增强型黄色荧光蛋白或EYFP的情况下。如前所述应用探测器和激光器设置后，根据需要根据获得的激光功率表修改激光强度。确保信噪比覆盖探测器的整个动态范围。
在对针孔直径进行微调，同时保持激光强度和检测器增益恒定后，执行FRET测量，拍摄至少20个细胞的图像。为了确定串扰校正，仅对表达供体荧光团的细胞和仅表达受体荧光团的细胞进行FRET测量。为了校准测量，使用表达供体受体融合的细胞进行FRET测量。
对于数据评估，获取像元的线轮廓，确保每个图谱包含不超过一个像元。将配置文件另存为文本文件。然后使用数据部分中的文本文件导入选项，将文本文件导入电子表格。
接下来，通过应用 max 函数读出最大值，然后在表中列出获得的值，该表中各有一列供体排放 ID、FRET 发射 IF、受体排放 IA，以及至少四个数据集（仅限供体、仅接受者、接受者融合和测量）。激光调整显示，随着激光强度的增加，发射线性增加。如陡峭的斜率所示，514纳米线的发射远高于458纳米线的发射。
在恒定激光功率下改变探测器增益揭示了两个被分析探测器的指数行为。用重组纯化蛋白分析的供体和受体的差异和光谱渗漏，以及用表达这些蛋白的细胞分析的差异和光谱渗漏表明，不可能省略可能由细胞色素引起的活细胞中光谱渗漏的测定。标记的空泡ATPA亚基，VHA AECFP和VHA AEYFP之间的FRET效率随着信号强度的增加而降低。
相反，VHA E1 ECFP和VHA CEYFP之间的相互作用与信号强度无关。选择合适的光学元件对于检测供体和受体至关重要。该协议也可以应用于活细胞中的比例传感器，以提高这些实验中的可重复性。
