该协议描述了使用供体淬灭和受体敏化发射量化FRET的分步实验过程和数学算法。活细胞中FRET效率的定量需要确定荧光蛋白的串扰以及显微镜装置中荧光团的相对发射和检测效率。串扰可以通过仅表达一个荧光团的细胞成像来评估。
评估供体或受体分子的检测效率需要了解产生测量信号的供体和受体分子的数量之比。活细胞中表达的荧光团数量因细胞而异，并且是未知的。该方法中使用的校准探针是一对一的供体-受体融合蛋白，可以确定供体和受体分子的相对检测效率。
首先，使用带有mCherry 1的N1哺乳动物细胞表达载体生成EGFP mCherry 1融合探针。设计寡核苷酸以扩增没有终止密码子的EGFP，作为细胞一个BAM h1片段。绿色和红色荧光蛋白之间的五个氨基酸接头应产生GFP樱桃供体 - 受体对的平均FRET缺乏0.25至0.3。
使用不含酚红的任何细胞系和培养基来减少背景荧光。一旦细胞汇合80%，用一毫升0.05%胰蛋白酶EDTA分离它们，并通过从5毫升细胞悬液中加入三滴，将约10， 000个细胞接种到八孔板的每个孔中。接种24小时后，使用适当的转染培养基转染细胞。
在活细胞成像前孵育细胞20小时，以允许适当的荧光蛋白表达，折叠和成熟。用共聚焦扫描显微镜在37摄氏度的加湿和加热的环境室中对细胞进行成像。为了在生理pH下缓冲细胞培养基，添加20毫摩尔HEPES以使细胞培养基二氧化碳独立。
然后将载玻片安装在显微镜上。使用氩离子激光器的488纳米线激发GFP，使用561纳米二极管激光器激发樱桃。设置 488 纳米激光器，用于在通道一中通过 505 至 530 纳米的发射带进行激发，在通道二中通过超过 585 纳米的长通滤光片进行激发。
使用 561 纳米激光器在通道三中使用超过 585 纳米的长通滤光片进行激发。依次激发两个激光器，并将成像模式设置为在每行之后切换，以便 512 x 512 像素图像的激发在每行之后交替。设置一个由三个图像组成的迷你时间序列，以检测是否发生明显的光漂白，并在必要时降低激光功率。
首先，对表达GFP樱桃融合构建体的细胞进行成像。设置定义共聚焦图像中每个像素的时间积分激光强度的参数。使用63倍油镜并将变焦设置为3倍，以足够的放大倍率和分辨率对整个细胞进行成像。
瞄准 70 到 80 纳米的像素大小。将像素停留时间设置为 2 到 4 微秒，并将 488 纳米和 561 纳米激光器的 AOTF 传输设置为图像，以便图像显示出良好的信噪比，没有任何漂白，也没有指示荧光强度饱和的像素。调整 488 和 561 的激光功率，使通道 1 和通道 3 中的信号电平相似。
将照片倍增增益设置为 600 到 800。图15至20表达GFP樱桃融合蛋白的细胞，表达GFP，樱桃，GFP和樱桃的细胞以及非横断面细胞。然后对细胞进行成像，分别共表达与GFP和樱桃偶联的目标蛋白。
要计算FRET，请测量通道1中的供体信号，该供体通道具有488纳米激发，发射带为505至530纳米。然后测量通道三中的受体信号，该受体通道用561纳米激发并在585纳米以上发射。最后，测量通道二中的FRET信号，该传输通道具有488纳米的激励和585纳米以上的发射。
通道二中的信号是四个不同分量的总和：从淬灭供体信号到具有串扰因子S1的超过585个检测通道的光谱溢出，来自具有串扰因子S2的488纳米光直接激发的受体信号，FRET从激发的供体分子中敏化发射的受体， 和背景信号。在供体通道、转移通道和受体通道中获得图像，显示仅表达GFP，仅樱桃，共表达GFP和樱桃的细胞以及GFP樱桃融合蛋白。绘制了表达GFP樱桃融合蛋白和共表达GFP樱桃的NRK细胞中计算的平均细胞FRET效率与每个细胞中的受体-供体比强度比或分子比的关系图。
此处显示了表达GFP樱桃融合蛋白，共表达GFP和樱桃作为阴性对照以及表达Ashwell-Morell受体受体亚基的细胞的标准化逐像素FRET图像。大鼠肝凝集素的RHL1和2在质膜的细胞质侧用GFP和樱桃标记。绘制表达GFP RHL1和樱桃RHL2以及GFP RHL1δ原液和樱桃RHL2的细胞的平均细胞FRET效率与受体-供体分子比的关系图。
所提出的定量FRET方法允许以下内容。检测活细胞生理环境中的蛋白质相互作用。蛋白质相互作用随时间的变化。
亚细胞区室中相互作用的差异低至共聚焦图像的逐像素水平。以及检测到的FRET信号对活细胞中表达的分子受体与供体比的依赖性。
