这种技术很重要，因为它可以测量活果蝇组织中特定细胞的葡萄糖摄取。基于FRET的传感器可以直接测量细胞内葡萄糖水平的变化。这项技术使研究人员能够实时评估ALS模型与对照组的活运动神经元内葡萄糖水平的变化。
一个具有挑战性的方面是在改变缓冲液后对同一组神经元进行成像。将样品留在显微镜上有助于确保VMC尽可能少地移动。在开始解剖之前，打开成像显微镜和激光。
然后收集游荡的三龄幼虫，用双蒸馏水冲洗，并将其滴在先前制备的弹性体衬里皿上的HL3缓冲液中。接下来在解剖显微镜下，使用一对镊子将幼虫的前后端，背侧朝上，用昆虫针小心地将幼虫纵向拉伸。使用一把倾斜的虹膜剪刀，在后针上方做一个切口。
然后从切口向幼虫的前端垂直切割。如果需要，在添加几滴HL3缓冲液后，切除气管和其余浮动器官，而不会干扰中枢神经系统。然后固定皮瓣，拉伸体壁以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统完整。
对于图像采集，请使用带有40倍水浸透镜的正置共聚焦显微镜。然后选择405纳米激光器来激发CFP。接下来，优化采集参数，如扫描速度、平均值、物镜、变焦针孔大小和空间分辨率。
调整增益，使信号处于最佳动态范围，并对所有基因型使用相同的参数。要对腹侧神经索内的运动神经元进行成像，请将带有解剖样品的硅胶培养皿放在晶状体下方并降低晶状体，使其与海藻糖蔗糖HL3缓冲液接触。确保镜头完全浸没在缓冲液中，并在需要时添加更多缓冲液。下一个。
使用CFP和FRET通道，手动选择由至少六个运动神经元组成的光学选择，这些神经元的焦点位于腹侧神经索中线。然后每 10 秒采集一次图像，持续 10 分钟。这些图像表示基线。
对于葡萄糖刺激，使用巴斯德移液管除去含有HL3缓冲液的海藻糖蔗糖，并加入五毫摩尔葡萄糖补充的HL3缓冲液，而不移动腹侧神经索。然后每隔 10 秒采集一次图像，再持续 10 分钟。这些图像代表刺激阶段。
将图像保存为CZI文件或成像软件支持的任何文件类型，文件名包括日期，遗传背景，实验条件和使用的通道。重用参数对所有基因型进行成像。要进行图像处理，请打开Fiji-ImageJ成像软件，然后打开CZI文件，选择具有超堆栈的视图堆栈并将颜色模式设置为灰度，然后选择将通道拆分到单独的窗口中。下一个。
使用漂移校正插件、turbo reg 和堆栈 reg 处理图像。通过选择插件下的堆栈 reg，然后选择转换为转换，可以单独更正每个通道。通过追踪在整个时间序列中保持焦点的所有运动神经元，手动选择感兴趣的区域或ROI。
然后使用 ROI 管理器保存每个运动神经元轮廓。使用多重测量函数来测量每个时间点每个 ROI 中的平均灰度值。然后将从第一通道跟踪的ROI复制到第二通道，以获得预刺激图像。
对于数据分析，请使用 FRET 和 CFP 通道的平均灰度值按 CFP 比率计算 FRET。CFP比率引起的FRET变化反映了细胞内葡萄糖浓度的变化。然后按 CFP 比率绘制每个 ROI 和时间点与时间的关系图。
基于遗传编码的基于FRET的葡萄糖传感器用于测量运动神经元中的葡萄糖摄取。当葡萄糖不结合到传感器时，CFP激发仅导致CFP发射。当葡萄糖结合时，由于CFP和YFP之间发生的FRET，可以检测到YFP信号。
这里显示的是基线和刺激条件下TDP-43突变神经元中葡萄糖传感器对照中的FRET和CFP信号的图像。每个图像中都概述了一个具有代表性的运动神经元，作为ROI的示例。在葡萄糖刺激下，表达葡萄糖传感器的控制运动神经元表现出葡萄糖摄取的小幅增加，而表达TDP-43的神经元表现出显着更高的葡萄糖摄取。
进一步的FRET通过CFP比率将TDP-43突变运动神经元在每个时间点归一化为葡萄糖传感器对照。在基线条件下，基因型之间没有差异。然而，在葡萄糖刺激下，与对照组相比，TDP-43突变体观察到葡萄糖摄取的快速显着增加。
在条形图表示中，表达葡萄糖传感器的神经元中的葡萄糖刺激表明，与基线相比，通过CFP比率计算，FRET增加了很小但显着。相比之下，与基线相比，表达TDP-43的神经元在刺激时的比率显着增加。表达TDP-43的运动神经元和葡萄糖传感器之间CFP比率的FRET净差异约为10.9%，时间管理对于该过程至关重要，因此神经元不会在成像过程中死亡。
在解剖后立即成像以避免这种情况很重要。这项技术强调了葡萄糖代谢在神经元中的重要性，并促使我们的小组进一步研究了糖酵解在运动神经元再生中的作用。
